小鼠真皮微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠真皮微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠真皮微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠真皮微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠真皮微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

处死小鼠，消毒，剪取背部皮肤，PBS 漂洗，去除皮下脂肪筋膜，DispaseⅡ4℃消化过夜，分离真皮组织，剪碎真皮组织。

加入胶原酶 I+DNase I 混合消化液，37℃水浴消化 45‑60min，间断吹打，充分解离微血管片段，完全培养基终止消化。

100μm、70μm 细胞筛依次过滤，除去大块组织残渣，收集全部细胞悬液，1000r/min 离心 5min，弃上清，PBS 洗涤沉淀 2 次。

采用免疫磁珠分选 CD31 阳性细胞，将细胞沉淀重悬，加入 CD31 磁珠抗体，4℃避光孵育，充分结合内皮细胞，磁柱捕获目标微血管内皮细胞。

洗脱磁柱上富集的内皮细胞，PBS 洗涤去除磁珠以及非特异性结合的杂细胞，获得纯化的真皮微血管内皮细胞。

内皮细胞专用完全培养基重悬细胞沉淀，计数，接种于明胶包被的培养板 / 瓶，放入 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育。

24h 后换液去除悬浮死细胞，每 48h 更换内皮专用培养基；观察鹅卵石样内皮细胞形态，汇合度 70‑80% 传代，避免成纤维细胞过度污染。