小鼠心脏微血管周细胞

方法简介  实验室分离的小鼠心脏微血管周细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠心脏微血管周细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠心脏微血管周细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠心脏微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织微血管片段

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、ECM基质胶、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液

仔细分离微血管片段，剪碎后加入II型胶原酶37度消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，300g离心10分钟收集细胞

采用免疫磁珠分选(抗PDGFR-beta抗体)富集周细胞

原代培养要点

周细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞呈梭形贴壁生长

常见问题优化

周细胞得率低：优化微血管分离方法，提高微血管片段纯度

内皮细胞污染：采用PDGFR-beta磁珠分选提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，使用低浓度血清培养

心脏微血管组织取材：小鼠安乐死后，无菌摘取心脏，预冷 PBS 冲洗干净，剪去心房、主动脉等大组织，剪碎心室，收集心肌微血管片段，剔除大块心肌纤维。

组织漂洗剪切处理：PBS 多次漂洗微血管组织，去除血液杂质，将微血管剪碎至 1‑2 mm 碎块，便于酶液渗透解离周细胞。

复合酶水浴消化：组织碎块放入含 Ⅱ 型胶原酶、DNaseⅠ 消化液，37℃水浴消化 35‑45 min，定时颠倒混匀，待组织松散，结束消化。

终止消化筛网过滤：加入周细胞完全培养基终止酶消化，充分吹打悬液，70 μm 细胞筛过滤除去未消化组织，收集单细胞悬液。

离心洗涤沉淀细胞：1100 r/min 离心 7‑8 min，弃上清废液，周细胞完全培养基重悬沉淀，二次离心洗涤，去除消化酶、血细胞碎片。

细胞接种孵育贴壁：调整细胞密度接种普通细胞培养瓶，37℃5% CO₂培养箱静置培养，接种后 24h 不要晃动培养瓶，利于周细胞贴壁生长。

换液纯化以及传代：24‑36h 后首次换液，去除悬浮内皮细胞、死碎片；每 2‑3 天更换培养基；细胞汇合 80% 左右进行传代，控制消化时间，减少内皮细胞残留污染。