小鼠心脏微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠心脏微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠心脏微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠心脏微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠心脏微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

心肌微血管组织取材：小鼠安乐死后消毒开胸，摘取完整心脏，预冷 PBS 冲洗心脏，剪去心房、大血管，切碎心室心肌组织，分离心肌内部微血管网络，剔除大块心肌组织。

组织清洗修剪碎化：PBS 反复冲洗微血管组织，冲净血液，将微血管剪碎至 1‑2 mm 组织碎段，充分暴露微血管管壁。

胶原酶消化解离细胞：碎组织移入 Ⅰ 型胶原酶‑DNaseⅠ 消化液，37℃水浴消化 30‑40 min，间歇摇晃，解离微血管管壁内皮细胞。

终止消化制备悬液过滤：内皮完全培养基终止消化，反复吹打组织，70 μm 筛网过滤悬液，除去结缔组织残渣，收集单细胞滤液。

离心洗涤去除红细胞碎片：1000 r/min 离心 7 min，弃上清，心脏微血管内皮完全培养基重悬沉淀，再次离心洗涤清除消化酶杂质。

明胶包被器皿接种：调节细胞密度，接种 0.1% 明胶包被培养瓶，置于 37℃、5% CO₂培养箱，接种 48h 内不移动培养瓶，便于内皮细胞贴壁。

换液纯化传代培养：24h 首次半量换液，去除悬浮杂细胞；每 2‑3 天换液，逐步去除心肌、成纤维杂细胞；细胞汇合 75‑85% 进行传代，严格控制胰酶消化时间。