小鼠心肌成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠心肌成纤维细胞采用胶原酶-胰蛋白酶联合消化结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠心肌成纤维细胞经Vimentin/α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠心肌成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠心肌成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

心脏组织无菌取材：小鼠安乐死后 75% 乙醇消毒胸腔，开胸快速摘取完整心脏，置于预冷无菌 PBS 缓冲液，挤净心腔内残留血液，剪除心房、大血管多余组织，保留心室心肌组织。

组织漂洗剪碎处理：PBS 反复冲洗心室组织，清除血液，无菌剪刀将心肌组织充分剪碎至 1 mm³ 组织糜，碎块越小，后续酶消化解离效率越高。

胶原酶分次消化组织：组织碎块转移至 Ⅰ 型胶原酶消化液，37℃水浴分批次消化，每次 10‑15 min，收集每次消化上清，未消化组织继续补加消化液反复消化。

差速贴壁去除心肌细胞：收集全部消化上清，加入完全培养基终止消化，70 μm 筛网过滤；先接种培养瓶孵育 90‑120 min，心肌细胞悬浮，成纤维细胞优先贴壁，弃掉悬浮心肌细胞悬液。

洗涤去除悬浮杂质：PBS 轻轻冲洗培养瓶，彻底清除未贴壁心肌细胞、血细胞和组织碎片，保留瓶底已经贴附的心肌成纤维细胞。

添加完全培养基孵育：向培养瓶加入心肌成纤维细胞完全培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱继续静置培养，观察细胞伸展形态。

换液传代扩增细胞：培养 24h 后更换新鲜培养基，之后每 2‑3 天换液；细胞汇合 80% 即可胰酶消化传代，该细胞增殖能力较强，注意不要过度培养，避免细胞老化。