小鼠小肠血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠小肠血管内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠小肠血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠小肠血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠小肠血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

小肠微血管组织取材：小鼠安乐死消毒开腹，取出小肠组织，预冷 PBS 冲洗肠腔，剥离肠系膜，仔细分离肠系膜表面细小微血管网络，剔除大块脂肪与结缔组织，全程保持组织低温湿润。

微血管清洗修剪：收集微血管组织，无菌 PBS 反复冲洗 3‑4 次，冲净血液，剪除掉粗大血管主干，只保留细小微血管片段，将微血管剪碎至 1‑2 mm 组织碎段。

胶原酶体系消化组织：碎组织转移至 Ⅰ 型胶原酶‑DNaseⅠ 消化液，37℃水浴消化 30‑40 min，间歇摇晃离心管，让酶充分解离微血管管壁内皮细胞。

终止消化制备单细胞悬液：加入内皮完全培养基终止消化，巴氏管充分吹打，离散细胞团，70 μm 无菌筛网过滤悬液，滤除结缔组织残渣，收集滤液。

离心洗涤去除红细胞碎片：1000 r/min 离心 7 min，弃上清，内皮细胞培养基重悬沉淀，二次离心洗涤，去除消化酶、破碎血细胞。

明胶包被培养板接种：调整细胞密度，接种预先 0.1% 明胶包被的培养器皿，置于 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育，48h 之内尽量避免挪动培养板，利于内皮贴壁。

换液筛选纯化细胞：24h 后半量换液，去除未贴壁杂细胞；每 2‑3 天换液，利用内皮细胞贴壁特性，逐步除去平滑肌、成纤维杂细胞；细胞汇合 75‑85% 进行传代，严格控制消化时间。