小鼠小肠黏膜上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠小肠黏膜上皮细胞采用先机械分离法、后胶原酶消化法并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠小肠黏膜上皮细胞经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠小肠黏膜上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠小肠黏膜上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

小肠组织取材处理：小鼠处死后腹部消毒，无菌摘取小肠，放入预冷 PBS 溶液，剥离肠系膜与表面脂肪，纵向剪开肠管，充分冲洗肠腔内粪便、食糜残渣。

肠组织解离预处理：将小肠剪成 2‑3 cm 肠段，放入含有 EDTA 解离缓冲液的离心管中，4℃低温摇床震荡孵育 20‑30 min，松动黏膜层上皮细胞与固有层之间连接。

震荡洗脱上皮隐窝团：取出肠段，更换新鲜 PBS，剧烈震荡离心管，洗脱小肠黏膜上皮以及隐窝细胞，弃去肠管组织，收集含有上皮细胞团的悬液。

过滤分离细胞团块：依次采用 100 μm、40 μm 细胞筛分级过滤，去除固有层结缔组织碎片，富集小肠上皮隐窝细胞团，收集过滤后的细胞悬液。

离心洗涤纯化沉淀：900 r/min 离心 6‑7 min，弃上清，小肠上皮细胞专用完全培养基轻柔重悬沉淀，再次离心洗涤，去除 EDTA 缓冲液残留以及红细胞。

基质胶包被板接种：将细胞悬液调整适宜密度，接种于提前铺好基质胶的培养板，置于 37℃、5% CO₂培养箱静置培养，上皮细胞团需要基质支撑利于存活贴壁。

定期换液观察增殖：接种 24h 后半量更换小肠上皮完全培养基，清除漂浮死细胞；后续每 2 天换液，观察上皮集落形成，避免杂细胞过度生长，原代小肠上皮细胞传代次数有限。