小鼠下腔静脉内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠下腔静脉内皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法、并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠下腔静脉内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠下腔静脉内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠下腔静脉内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

动物取材预处理：选取健康适龄小鼠，颈椎脱臼法安乐死，75% 乙醇全身浸泡消毒 3‑5 min，固定于无菌解剖板，逐层剪开腹腔，充分暴露下腔静脉，剔除血管周边附着的脂肪、结缔组织与淋巴结，操作全程保持组织浸润于预冷无菌 PBS 缓冲液，避免血管牵拉损伤内皮内膜。

血管组织剥离与清洗：精细显微镊子分离完整下腔静脉段，剪下目标血管组织，移入无菌培养皿内，预冷 PBS 反复冲洗管腔内外 3‑4 次，冲除管腔内残留血液、血细胞与组织碎屑，剪除血管两端受损部位，获取完整洁净血管组织片段。

酶消化孵育处理：将血管剪碎至 1‑2 mm 组织碎块，转移至含有内皮细胞专用 Ⅰ 型胶原酶‑DNaseⅠ 混合消化液的离心管，37℃水浴恒温消化 25‑35 min，每隔 5 min 轻柔颠倒离心管混匀，观察组织絮状松散状态，不可过度消化，防止内皮细胞活性受损。

终止消化与粗过滤：加入含胎牛血清的内皮完全培养基终止酶消化反应，充分吹打组织悬液，使用 70 μm 无菌细胞筛网过滤悬液，去除未消化完全的组织残渣，收集过滤后的单细胞悬液至无菌离心管。

离心洗涤去除杂质：1000 r/min 室温离心 5‑8 min，小心弃去上层上清废液，加入预热内皮细胞完全培养基重悬细胞沉淀，再次低速离心洗涤 1 次，去除残留消化酶、红细胞以及杂细胞碎片。

细胞接种铺板培养：用内皮完全培养基调整细胞悬液至合适细胞密度，接种于提前包被明胶的细胞培养瓶 / 培养板，置于 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱静置培养，接种后 24 h 内禁止晃动培养器皿，便于内皮细胞贴壁附着。

换液纯化与后续传代：培养 18‑24 h 后首次半量换液，去除未贴壁细胞、死细胞碎片；后续每 2‑3 天更换完全培养基，根据细胞汇合度进行传代，严格把控传代消化时间，抑制成纤维细胞等杂细胞过度增殖，完成原代细胞建系。