小鼠外周血树突状细胞(DC细胞)

方法简介  实验室采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，结合体外细胞因子诱导培养法制备该细胞。

质量检测  经树突状细胞特异性标志物（CD11c、MHC-Ⅱ、CD80、CD86）免疫荧光鉴定，本细胞纯度可达90%以上；经抗原提呈实验验证细胞功能正常；经检测不含有支原体、细菌、酵母和真菌等外源污染物，细胞活性达标。

培养基： 小鼠外周血树突状细胞完全培养基（含FBS、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-4、Penicillin、Streptomycin等）

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：半贴壁生长，成熟后悬浮或轻度贴壁

细胞形态：未成熟时呈圆形、短梭形；成熟后呈不规则形，表面有大量树突状突起

传代比例：1:2

传代特性：可传2-4代；1-2代以内细胞抗原提呈功能最稳定

消化液：0.25%胰蛋白酶

小鼠外周血树突状细胞(DC细胞)体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

细胞复苏：取出小鼠外周血树突状细胞冻存管，37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液融化完毕，酒精消毒管壁，移入超净工作台。

稀释冻存悬液：无菌将冻存管细胞悬液转移至装有预热 DC 细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释冻存保护剂，DC 细胞对毒性物质敏感度高。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸除上清，DC 细胞沉淀松散，吸取上清动作缓慢。

重悬细胞悬液：加入树突状细胞专用完全培养基，轻柔吹打沉淀，充分重悬，制备悬浮细胞悬液，部分细胞会半贴壁。

计数铺板接种：取样台盼蓝染色计数活细胞，调整细胞浓度，接种培养板。

恒温孵育培养：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱孵育 24‑48h，静置培养，减少开箱扰动。

换液与成熟诱导：半换液方式更换新鲜培养基，镜检细胞形态；可开展 DC 细胞成熟、抗原递呈相关体外实验。