小鼠外周血单个核细胞

方法简介  实验室分离的小鼠外周血单个核细胞采用取外周血、通过密度梯度离心法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠外周血单个核细胞，不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠外周血单个核细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 半贴壁半悬浮

细胞形态： 圆形

传代比例： 不传代

传代特性： 不建议传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠外周血单个核细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

细胞复苏：取出小鼠外周血单个核细胞冻存管，37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液融化完毕，酒精消毒冻存管外壁，移入超净工作台。

稀释冻存悬液：无菌将冻存管细胞悬液转移至装有预热 RPMI‑1640 完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，降低 DMSO 对免疫悬浮细胞的损伤。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，缓慢吸取弃除上清液，该细胞沉淀松散，操作防止细胞流失。

重悬悬浮细胞：加入外周血单个核细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，充分重悬，制备均匀悬浮细胞悬液，禁止剧烈吹打。

计数调整细胞浓度：取样台盼蓝染色计数活细胞，调整至实验需要的细胞浓度，接种悬浮培养瓶。

恒温悬浮孵育：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱竖立静置孵育 24h，悬浮培养，不要平放培养瓶。

离心换液与后续实验：通过离心方式更换新鲜培养基，镜检细胞存活情况；细胞可用于分离亚群、淋巴细胞刺激增殖实验。