小鼠视网膜微血管周细胞

方法简介  实验室分离的小鼠视网膜微血管周细胞采用中性蛋白酶-胶原酶联合消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠视网膜微血管周细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠视网膜微血管周细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每3-4天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠视网膜微血管周细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织微血管片段

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、ECM基质胶、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液

仔细分离微血管片段，剪碎后加入II型胶原酶37度消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，300g离心10分钟收集细胞

采用免疫磁珠分选(抗PDGFR-beta抗体)富集周细胞

原代培养要点

周细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

接种于纤维连接蛋白包被的培养皿中，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞呈梭形贴壁生长

常见问题优化

周细胞得率低：优化微血管分离方法，提高微血管片段纯度

内皮细胞污染：采用PDGFR-beta磁珠分选提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，使用低浓度血清培养

细胞复苏：取出小鼠视网膜微血管周细胞冻存管，置于 37℃水浴快速融化冻存液，冻存液完全融化，酒精消毒冻存管外壁，带入超净工作台。

稀释冻存悬液：无菌条件下将冻存管细胞悬液转移至装有预热周细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释冻存保护试剂。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心完毕，小心吸弃全部上清液体，保留管底细胞沉淀。

重悬制备细胞悬液：加入视网膜微血管周细胞专用完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团聚物，制备单细胞悬液。

计数铺板接种：取样台盼蓝染色计数活细胞，按照实验设定密度接种培养板，十字晃动培养板，让细胞均匀铺散。

恒温孵育贴壁：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24‑48h，减少外界扰动，保障周细胞贴壁生长。

换液及后续实验：显微镜观察周细胞形态，弃旧培养基更换新鲜培养基；细胞生长稳定，可开展血管周细胞损伤、共培养模型构建实验。