小鼠视网膜神经节细胞

方法简介  实验室分离的小鼠视网膜神经节细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法，结合视网膜神经节细胞专用培养基培养和化学试剂抑制法筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠视网膜神经节细胞经CD90免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠视网膜神经节细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠视网膜神经节细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

细胞复苏：取出小鼠视网膜神经节细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，冻存液完全融化，酒精消毒冻存管外壁，移入超净工作台。

稀释冻存悬液：无菌将冻存管细胞悬液转移至装有预热神经节细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，降低冻存试剂毒性，神经细胞对 DMSO 高度敏感。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，极其小心吸弃上清液，不要扰动脆弱细胞沉淀。

温和重悬细胞沉淀：加入视网膜神经节细胞完全培养基，极轻柔吹打沉淀，松散细胞团块，禁止大力吹打，防止大量神经细胞死亡。

计数铺板接种：取样台盼蓝染色计数活细胞，接种提前包被多聚赖氨酸的培养板，控制较低接种密度，十字缓慢晃动培养板。

恒温孵育培养：放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 48h，尽量少开启培养箱，维持稳定环境，利于神经细胞贴壁突起生长。

半换液与状态观察：采用半换液方式更换新鲜培养基，不要完全吸走全部旧培养液；显微镜观察神经突起生长，细胞状态稳定后开展神经损伤、凋亡相关体外实验。