小鼠视乳头星形胶质细胞

方法简介  实验室分离的小鼠视乳头星形胶质细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法、结合差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠视乳头星形胶质细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠视乳头星形胶质细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠视乳头星形胶质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

细胞复苏：取出小鼠视乳头星形胶质细胞冻存管，37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液融化完成，酒精消毒管壁，移入超净工作台。

稀释冻存悬液：无菌将冻存管细胞悬液转移至装有预热星形胶质细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释冻存保护剂。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸弃全部上清液，留存管底细胞沉淀。

重悬制备细胞悬液：加入视乳头星形胶质细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团块，神经类细胞操作全程动作轻柔。

计数铺板接种：取样台盼蓝染色计数活细胞，按合适密度接种包被后的培养板，十字缓慢晃动培养板，均匀铺散细胞。

恒温孵育贴壁：放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24‑48h，减少挪动，便于星形胶质细胞贴壁伸展。

换液与鉴定观察：孵育后显微镜观察细胞星状形态，弃旧培养基更换新鲜培养基；细胞生长稳定后，可开展胶质活化、神经损伤相关体外实验。