小鼠食管平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠食管平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠食管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠食管平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠食管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

细胞复苏：液氮取出小鼠食管平滑肌细胞冻存管，置于 37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液完全融化，75% 酒精消毒管壁，移入超净台。

稀释冻存悬液：无菌操作将冻存管细胞悬液转移至装有预热平滑肌细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释冻存保护剂。

离心收集细胞沉淀：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸弃全部上清液体，保留管底细胞沉淀。

重悬制备单细胞悬液：加入食管平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打管底沉淀，打散细胞团聚，制备均匀细胞悬液。

计数接种铺板：取样台盼蓝染色计数活细胞，按照实验需求密度接种培养器皿，十字摇晃培养板，使细胞均匀分布。

恒温孵育贴壁：放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24h，静置培养，减少外界扰动，利于平滑肌细胞贴壁伸展。

换液及后续实验：24h 显微镜观察长梭形平滑肌细胞形态，弃旧培养基更换新鲜培养基；细胞汇合至 80%，开展收缩功能、药物刺激相关体外实验。