小鼠肾小球系膜细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肾小球系膜细胞采用机械研磨法结合不同孔径不锈钢网筛过滤后使用胶原酶消化制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肾小球系膜细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠肾小球系膜细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肾小球系膜细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

细胞复苏：从液氮取出小鼠肾小球系膜细胞冻存管，放入 37℃水浴快速摇晃融化冻存液，冻存液完全融化后，酒精消毒管壁，移入超净台。

稀释细胞悬液：把冻存管中细胞悬液转移至装有预热系膜细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，降低冻存保护剂毒性。

离心收集细胞沉淀：配平离心管，1000r/min 离心 5min，离心完毕，小心吸弃全部上清液，保留管底细胞沉淀。

重悬制备单细胞悬液：加入系膜细胞完全培养基，轻柔吹打管底沉淀，打散细胞团聚物，制备分散良好的细胞悬液。

细胞计数铺板：取样进行活细胞计数，按照实验需要的细胞密度接种至培养瓶或者培养板，十字摇晃混匀细胞。

培养箱静置孵育：将培养器皿平稳放入 37℃、5% CO₂培养箱孵育 24h，静置不挪动，保障系膜细胞贴壁。

换液与传代处理：24h 后显微镜观察梭形系膜细胞形态，弃旧培养基更换新鲜培养基；待细胞汇合 80%‑85%，开展传代、高糖造模等体外实验。