小鼠肾小球内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肾小球内皮细胞采用先机械研磨过不锈钢网筛分离得到肾小球、后用胶原酶消化，结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肾小球内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠肾小球内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肾小球内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

细胞复苏：液氮取出小鼠肾小球内皮细胞冻存管，迅速置于 37℃水浴震荡融化，冻存液完全融化后，酒精消毒管壁，移入超净工作台。

稀释冻存细胞悬液：将冻存管内细胞悬液转移至装有预热内皮细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，稀释 DMSO，减轻细胞毒副作用。

离心收集细胞：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心结束，缓慢取出离心管，吸净上清液，留存底部细胞沉淀。

重悬制备悬液：加入肾小球内皮细胞专用完全培养基，轻柔吹打管底沉淀，打散细胞聚团，制备单细胞悬液，内皮细胞比较脆弱，吹打力度务必轻柔。

细胞计数接种：取样计数活细胞，按照内皮细胞适宜接种密度接种到包被明胶的培养板，十字摇晃培养器皿，让细胞均匀分布。

培养箱孵育贴壁：将培养器皿放入 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育 24h，期间避免搬动，方便内皮细胞贴壁伸展。

换液和状态监控：24h 后显微镜观察细胞梭形内皮形态，吸除旧培养基更换新鲜培养基；每日镜检，细胞汇合至 75‑80%，用于血管生成、炎症相关体外实验。