小鼠肾小管上皮细胞

方法简介  实验室采用胰蛋白酶-EDTA联合消化法结合差速贴壁法及免疫磁珠分选法（基于角蛋白CK8、CK18标志物）制备该细胞。

质量检测  经肾小管上皮细胞特异性标志物（角蛋白CK8、CK18、紧密连接蛋白ZO-1）免疫荧光鉴定，本细胞纯度可达90%以上；经尿素分泌、水钠重吸收功能检测验证细胞功能正常；经检测不含有支原体、细菌、酵母和真菌等外源污染物，细胞活性达标。

培养基： 小鼠肾小管上皮细胞完全培养基（含FBS、表皮生长因子、胰岛素、Penicillin、Streptomycin等）

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁生长，可形成单层上皮样细胞

细胞形态：圆形、多边形，汇合后呈铺路石样排列，细胞边界清晰

传代比例：1:2

传代特性：可传3-5代；2-3代以内细胞功能最佳，状态最稳定

消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（温和消化）

小鼠肾小管上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

细胞复苏：取出小鼠肾小管上皮细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，融化完毕，75% 酒精擦拭冻存管外壁，带入无菌超净台操作。

悬液稀释处理：将冻存管内细胞悬液转移至含有预热完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打，稀释冻存液，降低有机溶剂对上皮细胞的毒性。

离心沉淀细胞：离心管配平，1000r/min 离心 5min，离心完成后，小心吸走上层全部上清液，保留管底的细胞沉淀。

重悬细胞沉淀：加入肾小管上皮细胞专用完全培养基，反复轻柔吹打沉淀，打散细胞团块，得到均一的单细胞悬液，吹打时尽量减少气泡生成。

活细胞计数铺板：取部分悬液台盼蓝染色计数活细胞，按照实验需求设置接种密度，将细胞悬液分装至培养板，十字晃动培养板，使细胞分布均匀。

孵育贴壁培养：将培养板平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，静置过程中不要随意开启培养箱门扰动环境，利于上皮细胞贴壁伸展。

更换培养基及传代判断：孵育 24h 后镜检，观察鹅卵石样上皮细胞形态，弃旧培养基补加新鲜培养基；持续观察生长情况，细胞汇合达到 80%‑85%，开展传代或者造模实验。