小鼠肾动脉平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肾动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肾动脉平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肾动脉平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肾动脉平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

无菌实验准备：超净工作台紫外消毒 30min，准备小鼠肾动脉平滑肌细胞完全培养基、无菌 PBS、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液、无菌离心管、T25 培养瓶；37℃水浴回温试剂，平滑肌细胞消化时间需要严格控制，全部耗材酒精消毒移入超净台。

冻存细胞复苏融化：液氮罐取出冻存管，置于 37℃水浴快速晃动，1‑2min 融化冻存液；冻存管外壁酒精消毒移入操作台，细胞悬液转移至装有平滑肌完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀。

离心去除冻存保护剂：离心管配平，1000r/min 离心 5min；离心结束取出，超净台吸弃全部上层上清，留存管底细胞沉淀。

重悬计数接种培养瓶：加入预热肾动脉平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打管底沉淀制备单细胞悬液；细胞计数，调整接种密度，接种无菌培养瓶，摇匀细胞。

培养箱孵育贴壁伸展：放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育 24h，等待长梭形平滑肌细胞贴壁伸展。

换液清除死细胞碎片：孵育 24h，显微镜观察贴壁，弃旧培养基，PBS 缓冲液冲洗细胞层 1‑2 次，去除悬浮死细胞碎片；补入新鲜预热完全培养基放回培养箱，每 2‑3 天换液。

传代消化扩增处理：细胞汇合度达到 80%‑85% 开展传代；弃培养基，PBS 冲洗细胞层，加入胰酶消化液 37℃短暂消化；镜下细胞回缩变圆，加入含血清培养基终止消化；吹打收集全部细胞悬液，离心重悬分瓶，用于血管重构、血管收缩功能实验。