小鼠前列腺平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠前列腺平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠前列腺平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠前列腺平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠前列腺平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

前期无菌准备与试剂回温：超净工作台紫外消毒 30min，准备平滑肌细胞完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液、75% 酒精、无菌离心管、T25 培养瓶；水浴锅 37℃预热全部液体耗材，擦拭所有器具表面酒精后移入操作台，严格无菌，平滑肌细胞对消化时间十分敏感，提前把控消化条件。

细胞快速复苏融化：取出液氮冻存的小鼠前列腺平滑肌细胞冻存管，置于 37℃水浴快速晃动，1‑2min 完成冻存液融化；冻存管外壁喷洒酒精消毒，移入超净台，将细胞悬液转移至预装有完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，中和冻存保护剂毒性。

离心沉淀收集活细胞：离心管完成配平，设置 1000r/min 离心 5min；离心结束取出，超净台内吸弃全部上清，保留管底细胞沉淀，枪头避开沉淀，防止细胞丢失。

重悬计数接种培养：加入预热平滑肌细胞完全培养基，反复轻柔吹打管底沉淀，制备均匀单细胞悬液；进行细胞计数，调整合适接种密度，将细胞悬液接种至无菌细胞培养瓶中，平铺均匀。

恒温 CO₂培养箱孵育贴壁：将培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，不要频繁移动培养瓶，等待平滑肌细胞贴壁、伸展成长梭形形态。

换液清除死细胞碎片：24h 之后取出培养瓶，倒置显微镜观察贴壁情况，弃旧培养基，无菌 PBS 缓冲液缓慢冲洗细胞层两次，清除悬浮死细胞与碎片；添加新鲜预热完全培养基，放回培养箱，后续每 2‑3 天更换一次培养基。

细胞汇合后传代操作：镜下细胞汇合度到达 80%‑85%，开展传代；弃培养基，PBS 冲洗细胞层 2 次，加入胰酶消化液覆盖细胞表面，37℃短暂消化；镜下细胞回缩变圆，立刻添加含血清培养基终止消化；轻柔吹打瓶壁收集全部细胞悬液，离心重悬，分瓶接种继续扩增，用于后续收缩功能等相关实验。