小鼠脐静脉平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脐静脉平滑肌细胞采用胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脐静脉平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脐静脉平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脐静脉平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

复苏准备：开启超净台紫外消毒 30min，完全培养基、PBS、胰酶‑EDTA 消化液 37℃水浴预热，提前准备 T25 细胞培养瓶，标记细胞名称、日期、代数，75% 酒精擦拭所有试剂瓶外壁后移入超净工作台。

细胞复苏：取出冻存的小鼠脐静脉平滑肌细胞冻存管，37℃快速水浴晃动，1‑2min 完成融化，冻存管外壁酒精消毒，台内吸取细胞悬液，转移至装有预温完全培养基的离心管中轻柔吹打混匀。

离心去除冻存保护剂：配平离心管，室温 1000r/min 离心 5min，离心结束后小心弃去上层含 DMSO 的上清液，不要触碰底部细胞沉淀。

重悬接种：向离心管内加入适量专用完全培养基，轻柔吹打 8‑10 次充分打散细胞沉淀，制成均匀单细胞悬液，取样进行细胞计数，按照适宜接种密度接种至 T25 培养瓶，轻晃培养瓶使细胞均匀铺布。

细胞孵育培养：将培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱，静置培养，避免搬运晃动，24h 内不要移动培养瓶，方便细胞贴壁伸展。

换液观察：培养 24h 后取出培养瓶，显微镜观察细胞贴壁状态，吸弃旧培养基，使用无菌 PBS 轻柔漂洗细胞层 1 次，去除残留死细胞与碎片，更换新鲜预热完全培养基，放回培养箱继续培养。

传代处理：待细胞汇合度达到 80%‑85%，吸除培养基，PBS 清洗 2 次，加入胰酶‑EDTA 消化液，室温消化 2‑3min，显微镜下观察细胞回缩变圆，立刻加入完全培养基终止消化，吹打收集细胞悬液，离心后分瓶传代培养。