小鼠脐带间充质干细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脐带间充质干细胞采用组织贴块法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脐带间充质干细胞经CD29或CD44免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脐带间充质干细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脐带间充质干细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取材需严格无菌操作

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、MSC专用培养基/干细胞专用培养基、FBS、beta-巯基乙醇、L-谷氨酰胺

分离纯化步骤

从实验动物目标组织(骨髓/脂肪/脐带/牙髓等)中分离间充质成分

组织剪碎后经胶原酶消化(37度、2小时)，过滤获取单细胞悬液

采用密度梯度离心(Ficoll)纯化单个核细胞层

将细胞接种于培养皿中，间充质干细胞24-48小时贴壁，非贴壁细胞换液去除

贴壁细胞扩大培养至60-70%融合后，流式分选CD90+/CD105+/CD34-/CD45-细胞

原代培养要点

干细胞培养需使用专用培养基(含20%FBS的MSC培养基或DMEM/F12+20%FBS)

接种密度建议5x10^3-1x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，间充质干细胞呈梭形贴壁生长，融合达80%时传代

干细胞具有三系分化潜能，可在诱导培养基中向成骨/成脂/成软骨方向分化

常见问题优化

干细胞增殖缓慢：添加FGF-2(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可促进增殖

干细胞分化潜能下降：控制传代次数在3-5代以内，避免过度扩增

细胞纯度不高：采用流式分选CD90+/CD105+双阳性标记可提高纯度

复苏准备：小鼠脐带间充质干细胞完全培养基、无菌 PBS、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液 37℃水浴回温，超净台紫外照射 30min 灭菌，备好 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌移液耗材，核对冻存管编号，确认无渗漏破损。

冻存管水浴解冻：液氮罐取出冻存管，快速浸入 37℃水浴，轻柔摇晃冻存管 1‑2min，大部分冰晶融化，残留微小冰屑即可取出，75% 酒精擦拭冻存管外壁，移入超净工作台。

稀释离心去除冻存保护剂：无菌开启冻存管，将细胞悬液缓慢滴入装有 4mL 预热完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，沉降间充质干细胞，弃去含有 DMSO 的冻存上清液。

重悬铺瓶接种：离心完毕弃去上清，加入 2mL 脐带间充质干细胞完全培养基，轻柔吹打重悬底部细胞沉淀，充分打散细胞团块，将细胞悬液转移至 T25 培养瓶，补加足量完全培养基，多角度轻晃培养瓶，使细胞均匀铺布于瓶底。

恒温箱静置孵育：培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，不要频繁挪动培养瓶，利于间充质干细胞贴壁伸展。

换液清除死细胞碎片：孵育 24h 后取出培养瓶，吸弃全部旧培养基，无菌 PBS 轻柔漂洗细胞层一次，去除悬浮死细胞与碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日显微镜观察细胞梭形形态，排查细菌真菌污染。

传代扩增：细胞汇合度达到 80‑85%，吸弃培养基，PBS 清洗细胞层 2 次，加入胰酶消化液 37℃孵育 2‑3min，镜下细胞回缩变圆，加入完全培养基终止消化，吹打收集全部细胞悬液，离心，按 1:2‑1:3 比例分瓶传代继续培养。