小鼠脑膜细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脑膜细胞采用胰蛋白酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脑膜细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脑膜细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脑膜细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

复苏准备：小鼠脑膜细胞专用完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液 37℃水浴回温，超净工作台紫外照射 30min 完成灭菌，准备 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌枪头等耗材，核对冻存管编号，确认无破损漏液。

快速水浴解冻：取出液氮保存的细胞冻存管，浸入 37℃温水，轻柔摇晃冻存管 1‑2min，大部分冰晶融化，仅留少量冰屑即可取出，75% 酒精擦拭管壁，移入超净台内部。

稀释离心去除冻存保护剂：无菌开启冻存管，将细胞悬液缓慢滴入装有 4‑5mL 预热完全培养基的 15mL 离心管，轻柔吹打充分混匀，1000r/min 离心 5min，沉降活细胞，弃去含有 DMSO 的上层冻存液。

重悬细胞接种：倒掉离心后的上清液体，加入 2mL 脑膜细胞完全培养基，反复轻柔吹打管底细胞沉淀，打散细胞团聚块，将细胞悬液转移至 T25 培养瓶，补加培养基，多角度晃动培养瓶，使细胞均匀铺于瓶底。

培养箱静置贴壁：将培养瓶平稳放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，尽量减少移动，利于脑膜细胞贴壁生长。

换液观察细胞状态：孵育 24h 后取出培养瓶，吸除全部旧培养基，无菌 PBS 轻柔冲洗细胞层，去除悬浮死细胞以及碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日显微镜观察细胞形态，检查有无细菌真菌污染。

传代扩增操作：细胞汇合度到达 75‑80%，弃去瓶内培养基，PBS 洗涤细胞层 2 次，加入胰酶消化液，37℃消化 2‑4min，显微镜下看到细胞收缩变圆，立刻加入完全培养基终止消化，吹打收集全部细胞悬液，离心，按照合适比例分瓶传代继续培养。