小鼠脑静脉血管平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脑静脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脑静脉血管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠脑静脉血管平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脑静脉血管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

复苏准备：脑静脉血管平滑肌细胞完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液 37℃水浴回温，超净台紫外灭菌 30min，准备 T25 培养瓶、15mL 离心管、无菌枪头，核对冻存管信息，确认无漏液破损。

水浴解冻冻存管：液氮取出冻存管，浸入 37℃温水，轻柔摇晃冻存管 1‑2min，大部分冰晶融化，留有少量冰屑即可拿出，75% 酒精擦拭管壁，移入超净工作台。

稀释离心去除 DMSO：无菌拧开冻存管，细胞悬液缓慢滴加到装有 4.5mL 预热完全培养基的离心管，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，沉降活细胞，弃去上层冻存上清。

重悬铺瓶接种：倒掉离心上清，加入 2mL 平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打重悬管底细胞沉淀，打散细胞团块，转移悬液至 T25 培养瓶，补加培养基，水平晃动培养瓶，使细胞均匀铺在瓶底。

静置孵育贴壁：将培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置培养 24h，减少挪动，利于梭形平滑肌细胞贴壁伸展。

换液清除死细胞：培养 24h 后取出培养瓶，吸弃旧培养基，PBS 轻柔冲洗细胞层，去除漂浮死细胞、细胞碎片，更换预热新鲜完全培养基，放回培养箱，每日显微镜观察细胞生长状态，检查污染。

传代扩增：细胞汇合度 80‑85%，弃培养基，PBS 清洗细胞层 2 次，加入胰酶消化液，37℃孵育 2‑4min，镜下细胞收缩变圆，加入完全培养基终止消化，吹打收集全部细胞悬液，离心，按比例分瓶传代。