小鼠脉络膜血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脉络膜血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法并通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脉络膜血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠脉络膜血管细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脉络膜血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

复苏准备：提前将内皮细胞专用完全培养基、PBS 缓冲液、0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液置于 37℃水浴锅回温，紫外消毒超净台 30min，备好 T25 细胞培养瓶、离心管、移液枪耗材，佩戴无菌手套口罩，确认冻存管无破损漏液。

快速解冻：取出液氮储存的细胞冻存管，立即投入 37℃温水，轻柔摇晃 1‑2min，管内冰晶绝大部分融化，残留微小冰屑即可取出，75% 酒精擦拭冻存管外壁后移入超净台。

稀释离心：无菌打开冻存管，将细胞悬液缓慢滴加至装有 4‑5mL 预热完全培养基的 15mL 离心管中，轻柔吹打混匀，1000r/min 离心 5min，去除冻存保护剂 DMSO。

接种铺瓶：离心结束弃去上层上清液，加入 2mL 内皮细胞完全培养基，轻柔吹打重悬细胞沉淀，充分打散细胞团块，将细胞悬液转移至 T25 培养瓶，补加足量完全培养基，轻轻前后左右晃动培养瓶使细胞均匀分布。

培养孵育：将培养瓶平稳放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育，24h 内尽量不要挪动培养瓶，方便细胞贴壁，镜下观察细胞贴壁伸展状态。

换液观察：孵育 24h 后取出培养瓶，吸弃旧培养基，用无菌 PBS 轻柔漂洗细胞层 1 次，去除未贴壁死细胞与细胞碎片，更换新鲜预热的内皮细胞完全培养基，放回培养箱继续培养，每日显微镜观察细胞形态、密度、有无污染。

传代处理：当细胞汇合度达到 80%‑85%，吸走培养基，PBS 清洗 2 次，加入适量胰酶消化液，37℃孵育 1‑3min，显微镜下看到细胞收缩变圆，立刻加入完全培养基终止消化，吹打收集细胞悬液，离心后按合适比例分瓶传代，后续维持细胞正常培养。