小鼠脉络膜微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠脉络膜微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脉络膜微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠脉络膜微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠脉络膜微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，每只可获得2-5x10^5个内皮细胞，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、兔抗细胞CD31抗体(用于流式分选)、ECM基质胶

分离纯化步骤

取实验动物目标血管/组织，用预冷PBS冲洗去除血液，仔细分离去除外膜和脂肪组织

将组织剪碎后加入0.25%胰蛋白酶，37度消化15-20分钟，收集消化液

再加入II型胶原酶，37度振荡消化45-60分钟，充分分散组织

消化液经70um和40um滤网依次过滤，300g离心10分钟收集细胞

用含CD31抗体的磁珠进行阳性/阴性分选，或采用差速贴壁法去除成纤维细胞，收集CD31+内皮细胞

原代培养要点

将纯化后的内皮细胞接种于明胶预包被的培养皿中，使用ECM基质胶包被可显著提高贴壁率

接种密度建议3x10^4 cells/cm2，37度、5% CO2培养，内皮细胞通常24-72小时贴壁

使用内皮细胞专用培养基(含20%FBS、EGF 5ng/mL、FGF 2ng/mL、肝素10ug/mL)

每2-3天换液一次，细胞融合至80-90%时可用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代

常见问题优化

内皮细胞被成纤维细胞污染：采用差速贴壁法2-3次，或CD31磁珠分选提高纯度

内皮细胞凋亡：培养基中添加ROCK抑制剂Y-27632(10uM)可显著提高存活率

表达内皮标志物下降：传代次数控制在3代以内，冻存早期细胞以备后续使用

眼球与脉络膜组织取材：小鼠消毒处死后摘取完整眼球，预冷 PBS 保存；体视显微镜下剪开眼球巩膜，去除视网膜、晶状体、玻璃体，完整剥离脉络膜组织，小心剔除视网膜色素上皮残留组织，预冷 PBS 多次冲洗脉络膜组织。

组织剪碎与复合酶消化：脉络膜组织剪碎至细小组织碎块；加入胶原酶 Ⅱ+DNaseⅠ 复合消化液，37℃水浴摇床消化 45‑70 min，间隔 15 min 轻柔吹打；组织解离松散，加入内皮细胞完全培养基终止酶消化。

过滤处理得到粗细胞悬液：消化混合悬液过 200 目、400 目双层无菌细胞筛，除去结缔组织残渣，收集全部过滤后的细胞悬液转入无菌离心管。

离心沉淀细胞，初步重悬：1200 r/min 离心 7 min，弃去上清废液；加入脉络膜微血管内皮细胞专用完全培养基轻柔重悬底部细胞沉淀，打散细胞团聚物。

磁珠纯化与细胞接种铺板：使用 CD31 免疫磁珠分选纯化微血管内皮细胞，去除成纤维细胞、周细胞杂细胞；分选后活细胞计数，接种于明胶包被的细胞培养瓶板，放入 37℃、5% CO₂培养箱。

细胞培养维护，换液传代：接种 24 h 全量换液去除死细胞与磁珠碎片；后续每 2‑3 d 更换内皮完全培养基；细胞汇合至 75‑80%，温和胰酶消化分瓶传代，优先使用低代次细胞做体外血管相关实验。

细胞鉴定以及液氮冻存：CD31、VE‑cadherin 微血管内皮特异性标志物免疫荧光鉴定纯度；状态优良无污染细胞配置内皮细胞冻存液，程序梯度降温后液氮罐长期保存。