小鼠口腔黏膜成纤维细胞

小鼠口腔黏膜成纤维细胞

运用胶原酶 I 消化法从C57BL/6小鼠口腔黏膜成纤维细胞组织中提取间充质成分，经密度梯度离心去除血液细胞后，接种于胶原 IV 包被的培养表面，使用含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养；通过流式细胞术分析 CD90+、CD44+、CD105+ 阳性率及 CD34-、CD45- 阴性率，免疫荧光染色显示 vimentin 强阳性、角蛋白阴性，并经成纤维细胞集落形成实验验证增殖能力。

产品名称：小鼠口腔黏膜成纤维细胞

英文名称： Mouse Oral Mucosal Fibroblasts

组织来源： 口腔黏膜组织

默认种属 ：昆明小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠口腔黏膜成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠口腔黏膜成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠口腔黏膜成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠口腔黏膜成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

口腔黏膜组织取材：小鼠消毒处死后，无菌条件下撑开口腔，剪下颊部、口唇内侧口腔黏膜组织；置于预冷无菌 PBS 中，精细剔除黏膜下层肌肉、脂肪、腺体组织，PBS 反复冲洗组织表面血液、口腔分泌物。

组织剪切与上皮去除预处理：将黏膜组织剪切成小块，DispaseⅡ 酶 4℃孵育过夜，分离黏膜上皮层与下层结缔组织；次日撕除上皮层，只保留黏膜下层结缔组织，PBS 充分漂洗结缔组织碎块。

胶原酶消化解离组织：把结缔组织剪碎至 1 mm³ 碎块，加入 Ⅰ 型胶原酶消化液，37℃水浴摇床消化 60‑90 min，间隔 15 min 吹打混匀；组织充分松散后，加入成纤维细胞完全培养基终止消化。

过滤离心收集细胞沉淀：消化悬液过 200 目无菌筛网除去组织残渣；收集滤液，1000 r/min 离心 6 min，弃去上清废液，得到口腔黏膜成纤维细胞沉淀。

重悬计数、细胞接种铺板：成纤维细胞完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，打散细胞团；活细胞计数，调整细胞浓度接种至无菌培养瓶，放入 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱孵育。

细胞培养换液以及传代：接种 24 h 全量换液去除死细胞，之后每 2‑3 d 更换培养基；当细胞汇合度 80‑90%，PBS 清洗，胰酶消化，吹打制备单细胞悬液进行分瓶传代；控制传代代数，延缓细胞衰老。

细胞鉴定和冻存储备：Vimentin 成纤维细胞标志物免疫荧光鉴定；选取对数生长期无污染细胞配置冻存液，程序降温盒梯度降温，液氮长期冻存；复苏快速水浴融化，离心去除冻存液再接种培养。

1.取材过程中需保持组织湿润和低温，血管组织离体后超过30分钟会导致内皮细胞活力明显下降。

2.使用纤维连接蛋白(10ug/ml)包被培养器皿可显著改善内皮细胞贴壁速度和铺展形态。

3.内皮细胞体外具有增殖能力，传代比例建议1:3至1:4，细胞融合达80-90%时需及时传代避免接触抑制。

4.培养基中需添加EGM-2内皮细胞生长添加剂套装，包含VEGF、FGF-b、EGF和hydrocortisone等关键生长因子。

5.培养期间每48小时换液一次，观察细胞融合情况，融合度达90%以上时进行传代处理。