小鼠结肠平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠结肠平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠结肠平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠结肠平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠结肠平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

结肠组织取材分离：处死小鼠，无菌解剖取出结肠肠管，预冷 PBS 冲洗肠腔粪便；纵向剪开肠管，展平组织，使用显微镊子和棉签刮除表层结肠黏膜上皮，保留下层平滑肌组织，剔除外围脂肪、肠系膜结缔组织，预冷 PBS 反复冲洗组织。

组织剪碎预处理：将剥离干净的结肠平滑肌组织转移无菌培养皿，眼科剪充分剪切组织至 1 mm³ 大小碎块，PBS 洗涤组织碎块 2 次，吸净洗涤废液。

复合酶消化解离组织：加入 Ⅱ 型胶原酶 + 弹性蛋白酶混合消化液，完全浸没组织碎块；37℃水浴摇床 90 r/min 消化 60‑90 min，每 20 min 轻柔吹打，组织松散后，加入含血清平滑肌细胞完全培养基终止酶消化。

过滤除残渣，离心收集细胞：消化混合悬液过 200 目无菌细胞筛，除去未消化的组织纤维块；收集滤液，1000 r/min 离心 6‑7 min，弃上清废液，得到平滑肌细胞沉淀。

重悬计数、接种铺板：平滑肌细胞完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，打散细胞团，台盼蓝染色活细胞计数；调整合适细胞浓度接种至无菌培养瓶，放入 37℃、5% CO₂细胞培养箱。

培养换液与传代扩增：接种 24 h 后全量换液去除悬浮死细胞，后续每 2‑3 d 更换新鲜培养基；细胞汇合至 85‑90%，PBS 清洗，胰酶消化，吹打制成单细胞悬液分瓶传代；控制传代次数，避免细胞表型发生改变。

细胞鉴定和冻存保存：α‑SMA 平滑肌肌动蛋白标志物免疫荧光鉴定细胞纯度；选取对数生长期无污染细胞配置冻存液，程序降温盒梯度降温后置于液氮长期冻存；复苏快速融化，离心去除冻存保护剂再接种。