小鼠角膜上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠角膜上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠角膜上皮细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠角膜上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠角膜上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

角膜组织取材预处理：取小鼠眼球，无菌条件下摘取完整眼球，预冷 PBS 清洗；显微镜下分离完整角膜组织，去除巩膜、虹膜、晶状体等附属结构，PBS 反复冲洗角膜外表面血液与杂质。

上皮层分离获取：角膜上皮面朝上，用无菌棉签轻拭，或者采用 DispaseⅡ 酶 4℃过夜孵育角膜组织，促使上皮层与基质层分离；次日显微镊子完整撕取角膜上皮薄片，PBS 漂洗上皮组织碎片。

组织剪碎与胰酶消化解离：把上皮薄片剪碎至细小碎片，加入 0.25% 胰蛋白酶‑EDTA 消化液，37℃水浴消化 15‑25 min，期间间断吹打，待细胞充分解离，添加含血清上皮细胞培养基终止消化。

过滤、离心收集细胞沉淀：细胞悬液过 300 目无菌筛网除去组织残渣；收集滤液，1100 r/min 离心 6‑7 min，弃去上层废液，获得角膜上皮细胞沉淀。

重悬纯化，接种铺板：上皮细胞完全培养基轻柔重悬沉淀；采用差速贴壁去除少量成纤维细胞杂细胞，短暂预贴壁，收集未贴壁上皮细胞，计数之后接种于明胶包被的培养器皿。

细胞培养维护和换液：37℃、5% CO₂培养箱培养，接种 24 h 全量换液去除死细胞，之后每 2‑3 d 更换新鲜上皮完全培养基；观察细胞多边形上皮样克隆生长形态，严控成纤维细胞过度生长。

细胞鉴定、冻存保存：CK‑14、CK‑19 角蛋白标志物免疫荧光鉴定上皮细胞纯度；原代角膜上皮细胞传代次数有限，汇合 70‑80% 即可冻存，梯度降温液氮储存，复苏后尽快开展体外实验。