小鼠角膜内皮细胞

小鼠角膜内皮细胞

采用胶原酶 II 消化法从C57BL/6小鼠的角膜内皮细胞来源血管组织中分离内皮细胞，经预纯化（低贴壁培养去除成纤维细胞）后，接种于胶原 I 包被的培养皿中，使用 EGM-2 内皮专用培养基（含 VEGF、bFGF、EGF 及肝素）培养；通过免疫荧光染色检测 CD31（PECAM-1）、VE-cadherin、vWF 及 CD34 等内皮标志物，结合 Dil-acLDL 摄取实验和 CD31/VE-cadherin 双标免疫荧光确认内皮细胞身份与纯度。

产品名称：小鼠角膜内皮细胞

英文名称： Mouse Corneal Endothelial Cells

组织来源： 眼角膜组织

默认种属 ：昆明小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠角膜内皮细胞采用混合胶原酶消化结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠角膜内皮细胞经NSE（神经元特异性烯醇化酶）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 小鼠角膜内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠角膜内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

眼球与角膜取材处理：选取 6‑8 周龄小鼠，消毒处死后完整摘取眼球，浸泡预冷无菌 PBS；体视显微镜下，沿角膜缘剪开巩膜，完整分离角膜组织，剔除虹膜、晶状体等眼内组织，PBS 充分冲洗角膜内侧，清除色素碎屑。

内皮组织剥离收集：将角膜内皮面朝上放置于无菌培养皿，使用显微镊子小心撕取角膜内侧单层内皮组织，尽量不要混入角膜基质组织；收集撕下的内皮组织小块，PBS 漂洗去除附着色素颗粒。

酶消化解离内皮组织片：把收集的内皮组织小块移入离心管，加入 Ⅱ 型胶原酶消化液，37℃水浴孵育 40‑60 min，间隔 15 min 轻柔吹打，待组织解离，添加内皮细胞完全培养基终止酶消化作用。

过滤处理，离心富集细胞：消化悬液过 300 目无菌细胞筛，滤除未消化组织碎片；收集滤液，1200 r/min 离心 7 min，缓慢吸去上清，注意保护松散的角膜内皮细胞沉淀，不要吸走细胞。

细胞重悬、计数接种铺板：加入角膜内皮细胞完全培养基轻柔重悬细胞沉淀，台盼蓝计数活细胞；调整细胞密度接种到提前包被好明胶的培养板 / 瓶，放入 37℃、5% CO₂细胞培养箱孵育。

培养换液，杂细胞管控：接种后 24 h 进行全量换液，清除漂浮死细胞与色素碎片，之后每 2‑3 d 更换新鲜培养基；显微镜持续观察细胞多边形鹅卵石样形态，一旦发现成纤维细胞污染增殖，及时舍弃该批次细胞。

细胞鉴定以及冻存保管：采用 ZO‑1、Na⁺‑K⁺‑ATPase 内皮特异性标志物做免疫荧光鉴定；原代角膜内皮细胞增殖能力弱，尽量少传代；状态良好细胞配置冻存液梯度降温液氮保存，优先使用初代细胞开展实验。

1.操作过程需保持低温环境，室温下长时间暴露会导致细胞活力显著下降。

2.使用Matrigel基质胶稀释后包被培养器皿，4度过夜后37度预热使用。

3.该细胞类型体外培养寿命有限，原代细胞通常在5-10代内出现衰老现象。

4.补充10ng/ml表皮生长因子(EGF)和20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)。

5.建议传代比例为1:2，每2-3天更换新鲜培养基，维持细胞最佳生长状态。