小鼠甲状腺滤泡上皮细胞

方法简介  实验室分离的小鼠甲状腺滤泡上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠甲状腺滤泡上皮细胞经TG（甲状腺球蛋白）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠甲状腺滤泡上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠甲状腺滤泡上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

甲状腺组织解剖取材：选用 6‑8 周龄健康小鼠，75% 酒精消毒，颈椎脱臼法处死，仰卧固定，剪开颈部皮肤、皮下肌肉，暴露气管，精准分离附着于气管两侧的甲状腺组织，注意避开甲状旁腺、周围血管、脂肪结缔组织，预冷无菌 PBS 反复漂洗组织 3 次，清除血液污染。

组织修剪粉碎与预消化处理：在无菌培养皿中将甲状腺组织仔细剔除残余脂肪与结缔组织，眼科剪剪切组织至 0.5‑1 mm³ 细小碎块，PBS 洗涤碎块 2 次，弃去上清，加入胶原酶 Ⅰ+ 胰蛋白酶复合消化液，充分浸没组织碎块。

恒温振荡消化解离组织：将装有组织与消化液离心管放置 37℃水浴摇床，转速 100 r/min 消化 40‑60 min，每 15 min 取出轻柔吹打一次，显微镜下观察大部分滤泡结构解离，立即添加含胎牛血清的上皮细胞完全培养基终止酶消化反应。

筛网过滤与离心收集细胞：细胞混合悬液依次经过 100 目、300 目无菌细胞筛过滤，滤除未消化组织块，滤液收集于无菌离心管；1200 r/min 离心 7 min，小心吸除上层上清，避免扰动底部松散细胞沉淀。

细胞重悬、纯化以及接种铺板：加入甲状腺滤泡上皮专用完全培养基轻柔重悬沉淀；利用差速贴壁法去除成纤维细胞杂细胞，短暂预贴壁 30‑45 min，收集未贴壁上皮细胞悬液，细胞计数，按照合适密度接种于培养瓶 / 板。

细胞培养维持与换液操作：置于 37℃、5% CO₂培养箱孵育，接种 24 h 后更换全部培养基，去除死亡漂浮细胞，之后每 2‑3 d 更换新鲜完全培养基，观察细胞形成滤泡样上皮片状生长形态，警惕成纤维细胞过度增殖污染。

纯度鉴定和冻存保存：采用 CK‑19 甲状腺上皮特异性标志物免疫荧光鉴定细胞纯度；细胞生长至 70‑80% 汇合度时进行冻存，配置细胞冻存液，梯度降温后液氮保存；原代上皮细胞传代能力有限，尽量使用低代次细胞开展体外实验。