小鼠脊髓神经元细胞

小鼠脊髓神经元细胞

采用组织块贴壁法从C57BL/6小鼠的脊髓神经元细胞来源脑组织或神经节中分离神经元细胞，经 0.25% 胰蛋白酶和胶原酶 II 联合消化后，接种于多聚赖氨酸（PLL）/纤连蛋白双包被的培养表面，使用 Neurobasal 培养基（含 B27 添加剂、NGF 及 GlutaMAX）培养；通过免疫荧光染色检测神经元特异性标志物 β-III-tubulin（Tuj1）、MAP2、NeuN 及 synapsin-1 表达，结合倒置显微镜观察神经元突起延伸形态，并经膜片钳记录验证动作电位发放功能。

产品名称：小鼠脊髓神经元细胞

英文名称： Mouse Spinal Cord Neurons

组织来源： 脊髓组织

默认种属 ：昆明小鼠

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的小鼠脊髓神经元细胞采用胶原酶-胰酶联合消化法、神经元专用培养基培养筛选结合化学试剂抑制法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠脊髓神经元细胞经β-Tubulin-Ⅲ免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）

培养基： 小鼠脊髓神经元细胞完全培养基(含B-27 Supplement、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 神经元细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 0.125%胰蛋白酶

小鼠脊髓神经元细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

实验动物预处理与组织取材：选取出生 1‑3 d 的 SPF 级小鼠，75% 乙醇全身浸泡消毒 1‑2 min，断头处死，快速剥离背部皮肤与椎骨，暴露完整脊髓组织，预冷的无菌 PBS 缓冲液冲洗表面血液与杂质，小心剔除脊髓表面脊膜、血管以及附着的结缔组织，将剥离干净的脊髓转移至盛有预冷无菌 PBS 的培养皿内，全程操作置于冰上，最大程度降低细胞凋亡。

组织剪碎与酶消化处理：无菌眼科剪将脊髓组织反复剪切至 1 mm³ 左右的细小组织碎块，吸除多余 PBS，加入预热至 37℃的胰蛋白酶‑EDTA 消化液，组织与消化液体积比控制在 1:5，置于 37℃恒温水浴箱孵育 15‑20 min，每隔 5 min 轻柔颠倒摇晃一次，促进组织充分解离，消化结束后加入含 10% 胎牛血清的完全培养基终止酶消化反应。

细胞解离与粗筛过滤：使用无菌巴氏管对消化后的组织混合液进行反复轻柔吹打 20‑30 次，吹打力度避免产生大量气泡，促使神经元从组织块中游离，依次通过 200 目、400 目无菌细胞筛进行双重过滤，去除未消化完全的组织团块、纤维残渣，收集过滤后的单细胞悬液至无菌离心管中。

离心重悬与杂质去除：1000 r/min 室温离心 5 min，小心弃去上层上清废液，加入神经元专用完全培养基轻柔重悬细胞沉淀；采用差速贴壁法去除成纤维细胞等杂细胞，将细胞悬液转移至未包被的培养瓶，37℃、5% CO₂培养箱孵育 1‑2 h，成纤维细胞优先贴壁，收集尚未贴壁的神经元细胞悬液。

培养器皿包被与细胞接种：提前用多聚‑L‑赖氨酸包被培养板 / 培养皿，4℃过夜包被，使用前吸弃包被液，无菌 PBS 洗涤 2 次；将纯化后的脊髓神经元细胞进行细胞计数，按照适宜接种密度接种至包被完成的培养器皿，加入神经元专用完全培养基。

细胞培养与换液维护：放置于 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱进行培养，接种后 24 h 进行半量换液，后续每 2‑3 d 进行一次半量换液，换液操作时缓慢沿培养皿侧壁补加新鲜培养基，避免直接冲刷细胞层，防止神经元脱落，密切观察神经元胞体形态、突起生长延伸状态。

细胞鉴定与后续传代 / 冻存：培养 3‑5 d 后可进行细胞鉴定，采用免疫荧光染色检测 NeuN、Tuj‑1 神经元特异性标志物；原代脊髓神经元属于终末分化细胞不适合反复传代，如需保存，收集培养状态良好细胞，配置细胞冻存液，程序降温盒梯度降温后置于液氮长期保存，用于后续体外功能实验。

1.实验全程需在生物安全柜中操作，避免空气中的微生物污染培养体系。

2.培养表面需用纤维连接蛋白(10ug/ml)或层粘连蛋白包被，室温孵育2小时。

3.细胞在体外培养过程中需注意维持其分化表型，避免过度传代导致表型丢失。

4.添加5ng/ml转化生长因子-beta(TGF-beta)以调节细胞表型和功能维持。

5.实验选用C57BL/6或BALB/c小鼠，需注意小鼠品系差异对实验结果的影响。 传代时用PBS轻柔洗涤2次后加入0.25%胰蛋白酶，室温作用2-3分钟收集细胞。