小鼠肌腱成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肌腱成纤维细胞采用混合胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肌腱成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肌腱成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肌腱成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

无菌准备：超净台紫外灭菌 30min，肌腱成纤维细胞完全培养基、PBS、胰酶消化液，37℃水浴预热；T25 培养瓶、离心管，做好标记。

冻存细胞复苏：冻存管 37℃水浴快速融化，酒精擦拭管壁移入超净台，细胞悬液滴入装有完全培养基离心管轻柔混匀。

离心去除冻存保护剂：300g 室温离心 5min，吸弃上层冻存液上清。

重悬铺瓶：加入肌腱成纤维完全培养基，轻柔吹打打散细胞团，细胞计数，接种 T25 培养瓶，晃动培养瓶铺匀细胞。

孵育培养：37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育，复苏 48h 不要挪动培养瓶。

换液维护：48h 后首次换液，吸除旧培养基，PBS 冲洗细胞层，去除碎片死细胞，补新鲜培养基，每 2‑3 天换液，观察细长梭形肌腱成纤维细胞。

消化传代收获：细胞汇合 80%，弃培养基，PBS 清洗，胰酶消化，镜下细胞变圆，培养基终止消化；离心收集细胞，用于肌腱损伤修复体外研究。