小鼠颌骨成纤维细胞

方法简介  实验室分离的小鼠颌骨成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合酶消化后差速贴壁制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠颌骨成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠颌骨成纤维细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠颌骨成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

无菌准备：超净台紫外灭菌 30min，成纤维细胞完全培养基、PBS、胰酶消化液，37℃水浴预热；准备 T25 培养瓶、离心管，标记细胞信息。

冻存细胞复苏：冻存管 37℃水浴快速融化，酒精擦拭管壁转入超净台，细胞悬液滴入装有完全培养基离心管轻柔混匀。

离心去除冻存保护剂：300g 室温离心 5min，吸弃上层冻存液上清。

重悬接种：加入成纤维完全培养基，吹打打散细胞团，细胞计数，按推荐密度接种 T25 培养瓶，晃动培养瓶使细胞均匀铺底。

孵育贴壁：37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置培养，复苏 48h 不移动培养瓶。

换液维护：48h 后首次换液，吸除旧培养基，PBS 冲洗细胞层，去除死细胞碎片，补入新鲜培养基，每 2‑3 天换液，观察梭形成纤维细胞。

消化传代收集：细胞汇合 80%，弃培养基，PBS 清洗，胰酶消化，镜下细胞变圆，培养基终止消化；收集悬液离心计数，用于骨微环境共培养实验。