小鼠睾丸支持细胞

方法简介  实验室分离的小鼠睾丸支持细胞采用胶原酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠睾丸支持细胞经Fas-L免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠睾丸支持细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠睾丸支持细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取胰腺/睾丸/肾上腺等内分泌腺体

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS

分离纯化步骤

取实验动物目标内分泌腺体组织，仔细去除周围结缔组织

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、45-60分钟)分散细胞

经滤网过滤后，采用密度梯度离心纯化目标细胞

胰岛细胞可采用Handy solution差速沉淀法进一步纯化

原代培养要点

胰岛beta细胞：使用CMRL-1640+10%FBS+10mM HEPES+50uM beta-巯基乙醇

睾丸间质细胞：使用DMEM/F12+10%FBS+0.1% BSA培养

肾上腺皮质细胞：使用DMEM/F12+5%FBS+0.1uM地塞米松培养

常见问题优化

胰岛细胞纯度不高：采用Handy solution梯度离心可获得纯度>90%的胰岛细胞

内分泌细胞功能维持：添加相应激素(如IGF-1、IGF-2)可维持细胞功能

细胞存活率低：培养基中添加抗坏血酸和转铁蛋白可提高存活率

细胞复苏：取出冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，残余少量冰晶取出，75% 酒精擦拭外壁送入超净台。

转移稀释：无菌打开冻存管，细胞悬液移入睾丸支持细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀。

离心洗涤：1000r/min 离心 5min，离心完毕，弃除上层冻存上清，保留细胞沉淀。

重悬细胞沉淀：加入预热睾丸支持细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团块，制备均匀悬液。

接种铺板：细胞计数，按实验密度接种培养瓶，十字轻晃，均匀铺布细胞。

孵育贴壁：放置 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育 24‑48h，给细胞充足贴壁伸展时间。

换液监测：48h 更换新鲜培养基，后续每 2‑3 天换液，观察多边形支持细胞形态，汇合 80% 开展相关实验。