小鼠肝实质细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肝实质细胞采用混合酶灌流消化、反复低速离心制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肝实质细胞经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 小鼠肝实质细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、Insulin、Dexamethasone、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1代，不建议传代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肝实质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，取肝脏组织约2-3g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、William E培养基/KSOM培养基、FBS、PBS、肝素

分离纯化步骤

取实验动物肝脏组织，通过门静脉灌注0.25%胰蛋白酶(37度、20分钟)

取出肝脏，剪碎后加入II型胶原酶37度振荡消化45-60分钟

消化液经70um和40um滤网过滤，100g离心5分钟收集肝细胞

采用Percoll不连续密度梯度离心(30%/60%)纯化肝细胞

原代培养要点

肝细胞：使用William E培养基+10%FBS+100nM地塞米松+10ug/mL胰岛素

肝细胞接种后4-6小时开始贴壁，24小时内形成典型多角形上皮样细胞

肝细胞培养3-7天后功能逐渐下降，建议实验在培养7天内完成

肝星状细胞：使用DMEM/F12+10%FBS培养，细胞呈成纤维细胞样生长

常见问题优化

肝细胞活力差：灌注压力控制在10-12mmHg，消化时间严格控制

肝细胞功能丧失：培养基中添加HGF(10ng/mL)和EGF(10ng/mL)可维持肝细胞功能

肝星状细胞活化：传代后细胞逐渐活化，建议冻存早期细胞

复苏解冻：取出冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，剩微小冰晶取出，75% 酒精擦拭管壁带入超净台；肝细胞比较脆弱，全部操作降低剪切力。

悬液转移：无菌打开冻存管，细胞悬液缓慢移入肝实质细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀。

低速离心：900r/min 离心 6min，降低转速减少肝细胞破损，离心结束轻柔吸弃上清冻存液。

重悬沉淀：加入预热肝实质细胞完全培养基，使用大口径枪头缓慢吹打 3‑5 次，松散沉淀，不要反复吹打。

接种铺板：细胞计数，按实验密度接种胶原包被的培养板，十字轻轻晃动。

孵育贴壁：放入 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育 24‑48h，全程尽量不移动培养器皿。

换液观察：48h 后半量更换新鲜培养基，后续每 2‑3 天半量换液，观察多边形肝细胞形态，不要等到长满，汇合 70‑80% 即可开展实验。