小鼠肺微血管平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肺微血管平滑肌细胞采用混合胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肺微血管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肺微血管平滑肌细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、EGF、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肺微血管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

冻存复苏：取出冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，残留微量冰晶取出，酒精擦拭外壁移入超净台。

稀释转移：开启冻存管，细胞悬液转移至盛有平滑肌完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀。

离心洗涤：1000r/min 离心 5min，离心完成，弃去上层上清液，留存底部细胞沉淀。

重悬细胞：加入预热肺微血管平滑肌细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞结块，制备均匀悬液。

接种铺板：细胞计数，按标准密度接种，十字摇晃培养器皿，细胞均匀铺展。

孵育贴壁：置于 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育 24h，不移动培养容器。

换液观测：24h 更换新鲜培养基，每 2‑3 天换液，观察梭形平滑肌形态，汇合 80‑90% 进行传代。