小鼠肺泡巨噬细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肺泡巨噬细胞采用机械研磨结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肺泡巨噬细胞经CD68免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肺泡巨噬细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 利多卡因（12 mM）

小鼠肺泡巨噬细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

复苏解冻：取出冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，剩余微小冰晶取出，75% 酒精擦拭管壁送入超净台；巨噬细胞对冻存毒性敏感，操作全程快速。

悬液转移：无菌打开冻存管，将细胞悬液缓慢移入肺泡巨噬细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒混匀。

离心洗涤：1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸弃上层冻存上清，保留松散细胞沉淀，不要大力冲刷沉淀。

重悬细胞：加入预热肺泡巨噬细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，适度打散细胞团，避免过度吹打造成细胞活化损伤。

接种铺板：细胞计数，按照实验密度接种培养板，十字轻轻晃动，巨噬细胞贴壁速度较快。

恒温孵育：放入 37℃、5% CO₂培养箱静置孵育 12‑24h，让细胞充分贴壁活化。

换液观察：12‑24h 后更换新鲜培养基去除未贴壁死细胞，后续每 2‑3 天换液，观察巨噬细胞多边形贴壁形态，避免培养时间过长发生过度活化。