小鼠肠系膜平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肠系膜平滑肌细胞采用中性蛋白酶-胶原酶联合消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肠系膜平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肠系膜平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代左右

消化液： 0.25%胰蛋白酶

小鼠肠系膜平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

冻存细胞复苏：从液氮罐取出冻存管，立即置于 37℃水浴锅中快速摇动，加速冻存液融化，留有微量冰晶即刻拿出，酒精擦拭冻存管外壁进行灭菌处理。

悬液转移稀释：超净台环境下开启冻存管，把细胞悬液缓慢移入盛有平滑肌细胞完全培养基的 15mL 离心管，轻柔颠倒离心管 3‑4 次稀释冻存液。

离心洗涤：设置离心机参数 1000r/min，离心 5min，离心完毕后，小心吸除上层冻存上清，注意不要吸走管底的细胞沉淀。

细胞重悬：加入预热的小鼠肠系膜平滑肌细胞专用完全培养基，使用移液枪缓慢吹打细胞沉淀，充分打散结块细胞，配制成分散良好的细胞悬液。

计数接种：进行细胞计数，按照标准接种密度接种于培养瓶，十字摇晃培养瓶，让细胞均匀铺在培养瓶底面，减少细胞局部堆积。

孵育贴壁：放置于 37℃，5% CO₂恒温细胞培养箱静置孵育，24 小时之内尽量不要移动培养容器，保障细胞充分贴壁伸展。

换液监测：孵育 24h 后观察细胞贴壁情况，更换新鲜完全培养基，之后每 2‑3d 换液，显微镜观察细胞梭形平滑肌特征形态，细胞汇合至 80%‑90% 进行传代处理。