小鼠肠巨噬细胞

方法简介  实验室分离的小鼠肠巨噬细胞采用酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的小鼠肠巨噬细胞经CD68免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  小鼠肠巨噬细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 巨噬细胞样

传代比例： 不传代

传代特性： 属于终末分化细胞；属于不增殖细胞群

消化液： 利多卡因（12 mM）

小鼠肠巨噬细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：C57BL/6小鼠，采集血液或提取组织免疫细胞

试剂：Ficoll密度梯度分离液、PBS缓冲液、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RPIM-1640或DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

采集实验动物全血或获取组织悬液，用PBS稀释至适当体积

缓慢叠加于Ficoll密度梯度分离液上方，室温2000rpm离心20分钟

收集界面白色单个核细胞层，用PBS洗涤2次，300g离心8分钟

用含10%FBS的RPIM-1640完全培养基重悬细胞，计数并检测活力

可采用磁珠分选法进一步富集目标免疫细胞亚群(如CD11b+巨噬细胞、CD3+T细胞等)

原代培养要点

免疫细胞多为悬浮或弱贴壁生长，使用完全培养基RPIM-1640+10%FBS+1%双抗

37度、5% CO2培养，初始接种密度建议1x10^6 cells/mL

巨噬细胞培养可添加M-CSF(20ng/mL)促进增殖和维持表型

T细胞培养需添加IL-2(10ng/mL)和抗CD3/CD28抗体刺激增殖

常见问题优化

免疫细胞活力差：操作全程保持低温，避免反复离心和吹打

细胞凋亡：培养基中添加IL-4(20ng/mL)和IL-10(10ng/mL)可抑制巨噬细胞凋亡

纯度不够：采用MACS磁珠分选可获得纯度>95%的目标免疫细胞

步骤一：免疫细胞无菌准备 提前40分钟紫外消毒生物安全柜，巨噬细胞为免疫细胞，易受污染、活性易受损，需高标准无菌环境。提前预热巨噬细胞专用完全培养基、无菌PBS、无EDTA温和消化液，排查试剂无内毒素、无杂质。操作人员全程无菌防护，规范操作流程，杜绝杂菌污染与试剂刺激。

步骤二：超温和解冻复苏 取出冻存的小鼠肠巨噬细胞，37℃水浴极轻柔解冻，严格控制解冻时间≤1分钟，留存微量冰晶立即取出，避免高温损伤免疫细胞活性。消毒冻存管外壁，无菌缓慢转移细胞悬液至预热完全培养基中，轻柔混匀，稀释冻存保护剂，保留细胞免疫活性。

步骤三：超低速离心纯化 设置离心机室温200g、7分钟超低速离心，避免巨噬细胞破损、活性下降。离心后缓慢吸弃上清废液，保留完整细胞沉淀，加入预热无菌PBS缓冲液温和重悬，再次离心清洗，彻底清除残留杂质与冻存剂。

步骤四：悬浮适配接种 吸净PBS废液，加入巨噬细胞专用培养基，轻柔吹打制备均匀细胞悬液，计数后调整细胞密度至1×10⁵个/mL，巨噬细胞多为半贴壁生长，均匀接种可保证细胞正常存活、发挥免疫功能。缓慢晃动培养瓶，使细胞均匀分布。

步骤五：恒温静置功能培养 将培养瓶置于37℃、5%CO₂饱和湿度培养箱静置培养24小时，全程稳定环境参数，不扰动培养瓶，利于巨噬细胞适应培养环境、维持正常免疫吞噬功能。

步骤六：半量低频换液 培养24小时后进行首次半量换液，仅更换1/2新鲜预热培养基，保留原有细胞生长微环境，避免环境骤变导致细胞活性下降。后续每72小时半量换液一次，持续维持培养基营养与酸碱平衡，保护细胞功能活性。

步骤七：轻柔传代保功能 细胞密度达标后进行传代，无需强力消化，采用无EDTA消化液温和消化3分钟，轻柔吹打收集半贴壁巨噬细胞，低速离心重悬后按1:2比例传代。全程操作轻柔，避免损伤细胞结构与免疫功能，定期观察细胞形态与活性。