兔主动脉平滑肌细胞

方法简介  实验室分离的兔主动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔主动脉平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔主动脉平滑肌细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔主动脉平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，组织取材需保持血管/器官完整性

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、平滑肌细胞专用培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织(血管/器官平滑肌层)，用预冷PBS反复冲洗去除血液

仔细分离去除外膜和黏膜层，仅保留平滑肌层组织，剪碎至1-2mm3

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合液，37度消化40-60分钟，期间振荡2-3次

消化完成后过滤(70um+40um)，300g离心10分钟收集细胞沉淀

细胞悬液接种于培养皿中，采用差速贴壁法24小时后换液去除非贴壁细胞

原代培养要点

平滑肌细胞贴壁能力较强，接种后24-48小时可见贴壁细胞呈梭形生长

使用含20%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时进行传代

平滑肌细胞传代时使用0.25%胰蛋白酶消化5-10分钟，离心收集后重新接种

常见问题优化

细胞纯度不高：可采用药物筛选法(5-氟尿嘧啶20uM处理48小时去除非平滑肌细胞)

平滑肌细胞表型转换：控制传代次数在5代以内，培养基中保持适当FBS浓度(10-20%)

细胞生长缓慢：添加10ng/mL PDGF-BB可促进平滑肌细胞增殖

1. 细胞复苏：取出冻存兔主动脉平滑肌细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存液，留有微小冰晶取出冻存管，酒精擦拭管壁消毒，移入安全柜，将细胞悬液缓慢转移至平滑肌细胞完全培养基的离心管。

2. 离心去除冻存保护剂：离心管配平，1000rpm 离心 5min，离心结束，小心吸弃上层冻存上清液，保留完整管底细胞沉淀。

3. 重悬离散细胞沉淀：加入预热兔主动脉平滑肌细胞完全培养基，轻柔反复吹打管底沉淀，打散细胞团块，制备均匀单细胞悬液。

4. 计数接种培养瓶：活细胞计数，按照血管平滑肌细胞标准接种密度接种，接种完毕十字轻晃培养瓶，细胞均匀铺展瓶底。

5. 培养箱静置贴壁孵育：培养瓶置于 37℃、5% CO₂饱和湿度细胞培养箱，静置孵育 24h，减少移动，保证平滑肌细胞充分贴壁。

6. 初次换液清除悬浮杂质：24h 后显微镜镜检贴壁状态，弃除旧培养基，清除悬浮死细胞碎片，补入预热新鲜完全培养基放回培养箱。

7. 常规培养传代实验：间隔 2‑3 天更换新鲜培养基，观察纺锤形平滑肌细胞形态，汇合度 80‑85% 消化传代，用于动脉粥样硬化、血管重构体外研究。