兔真皮微血管内皮细胞

方法简介  实验室分离的兔真皮微血管内皮细胞采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法结合密度梯度离心法、最后通过内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔真皮微血管内皮细胞经CD31免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 兔真皮微血管内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔真皮微血管内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取目标组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、相应专用培养基组分

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷PBS冲洗去除血液和杂质

剪碎组织后采用胶原酶消化法(37度、1-2小时)分散细胞

过滤后300g离心8-10分钟收集细胞

根据细胞类型采用适当方法进一步纯化(密度梯度离心/免疫磁珠分选/差速贴壁)

原代培养要点

将纯化后的细胞接种于适当包被的培养皿中

使用含10%FBS的DMEM/F12完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，根据细胞生长特性调整培养条件

常见问题优化

细胞得率低：根据组织特性优化消化时间和酶浓度

细胞纯度不高：采用多种纯化方法联合使用提高纯度

细胞表型维持：控制传代次数，必要时采用特殊培养基或包被基质

1. 细胞复苏：取出冻存兔真皮微血管内皮细胞冻存管，37℃水浴快速融化冻存样本，少量冰晶残留取出，酒精消毒管壁，安全柜中将细胞悬液缓慢加入内皮细胞专用完全培养基的离心管。

2. 离心去除冻存保护剂：离心管配平，1000rpm 离心 5min，离心结束，小心吸除上清冻存液，内皮细胞沉淀松散，吸上清时避免触碰管底。

3. 温和重悬细胞沉淀：加入预热兔真皮微血管内皮细胞完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团块，制备单细胞悬液，内皮细胞对机械剪切耐受弱，吹打力度轻柔。

4. 计数接种培养瓶：活细胞计数，按照微血管内皮细胞适宜接种密度接种，接种完成十字轻晃培养瓶，细胞均匀分布培养底面。

5. 培养箱静置孵育贴壁：培养瓶放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，静置孵育 24h，减少移动，保障内皮细胞贴壁。

6. 初次换液去除悬浮碎片：24h 后显微镜镜检贴壁状态，弃旧培养基，清除悬浮死细胞碎片，添加预热新鲜完全培养基放回培养箱。

7. 维持培养传代实验：间隔 2‑3 天更换培养基，观察内皮细胞多边形形态，汇合度 80%‑85% 进行消化传代，用于血管生成相关体外模型。