兔视网膜色素上皮细胞

方法简介  实验室分离的兔视网膜色素上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔视网膜色素上皮细胞经PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔视网膜色素上皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： Accutase消化液或0.25%胰蛋白酶

兔视网膜色素上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

一、实验前准备

1. 显微眼科器械、培养皿、离心管灭菌；暗环境超净台操作。

2. 试剂：预冷含双抗 PBS、0.25% 胰酶、DMEM 高糖完全培养基。

3. 兔子麻醉处死工具，冰盒备用。

二、取材与预处理

1. 麻醉处死家兔，摘除眼球，75% 酒精浸泡眼球外壁消毒，PBS 冲洗。

2. 显微镜下沿角膜缘剪开眼球，去除晶状体、玻璃体、神经视网膜层，仅保留眼球后壁色素上皮层。

三、细胞分离与消化

1. 剪取 RPE 组织剪碎，加入胰酶 37℃消化 20min。

2. 完全培养基终止消化，轻柔吹打使色素上皮细胞脱落分散。

3. 离心收集细胞沉淀，PBS 洗涤去除黑色素碎片。

四、纯化与接种培养

1. 滤网过滤去除大块组织，细胞悬液接种培养瓶。

2. 37℃培养，12h 后首次换液去除未贴壁杂质。

3. 细胞融合至 85% 左右常规胰酶传代培养。