兔视网膜muller细胞

方法简介  实验室分离的兔视网膜Muller细胞采用胶原酶消化法和胰蛋白酶反复消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔视网膜Muller细胞经GS免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔视网膜Muller细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、EGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔视网膜Muller细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

倒置显微镜检视兔视网膜 muller 细胞，汇合 75‑80% 进行传代，细胞形态完整，无微生物污染，吸除瓶内旧培养基。

无菌 PBS 缓冲液漂洗细胞贴壁层 2 次，缓慢摇晃培养瓶去除代谢碎片，漂洗结束彻底吸净 PBS 缓冲液。

预热胰酶消化液加入瓶内覆盖细胞，37℃5% CO₂培养箱消化 3‑4min，镜下细胞收缩变圆，马上终止消化，muller 细胞对消化较为敏感。

加入视网膜 Müller 细胞完全培养基中和胰酶，轻柔吹打瓶壁，将细胞吹落，制备细胞悬液，降低机械剪切损伤。

细胞悬液转入无菌离心管，1000r/min 离心 5min，离心完成，小心吸弃上清废液，留存管底细胞沉淀。

Müller 细胞专用完全培养基重悬细胞沉淀，充分混匀，细胞计数，接种新的无菌培养容器。

平缓摇动培养瓶使细胞均匀分布，放置 37℃、5% CO₂培养箱，24h 观察贴壁状态，每 2‑3 天更换培养基。