兔神经星形胶质细胞

方法简介  实验室分离的兔神经星形胶质细胞采用酶消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔神经星形胶质细胞经GFAP免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔神经星形胶质细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、EGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 梭形、多角形

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔神经星形胶质细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取脑组织或脊髓组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、EGF、FGF-b、PDGF-AA

分离纯化步骤

取实验动物脑组织或脊髓组织，用预冷PBS冲洗去除血液

去除脑膜和血管组织，将目标区域剪碎至1mm3

用0.25%胰蛋白酶消化20分钟，再加入II型胶原酶消化30分钟

过滤后300g离心8分钟收集细胞，重悬于含EGF和FGF-b的培养基中

采用磁珠分选或差速培养法富集目标胶质细胞类型

原代培养要点

胶质细胞(星形胶质细胞/少突胶质细胞/小胶质细胞)培养条件略有差异

星形胶质细胞：DMEM/F12+10%FBS，37度、5% CO2，细胞呈多角形贴壁生长

少突胶质细胞：需PDGF-AA维持增殖，分化期添加T3、甲状腺素促进成熟

小胶质细胞：采用振荡分选法从混合胶质细胞中分离，悬浮或弱贴壁生长

常见问题优化

胶质细胞交叉污染：采用免疫磁珠分选可提高纯度至90%以上

少突胶质细胞分化率低：添加C57条件培养基或IBMX可促进少突胶质细胞成熟

小胶质细胞活化：避免过度培养，原代培养5代以内保持静息态表型

倒置显微镜检视兔神经星形胶质细胞，汇合度 80‑85% 开展传代，胞体星状形态完整，无污染，吸除培养瓶旧培养基。

无菌 PBS 缓冲液漂洗细胞贴壁层 2 次，缓慢摇晃培养瓶去除代谢碎片，漂洗结束彻底吸净 PBS 缓冲液。

加入预热胰酶消化液浸润全部细胞，37℃5% CO₂培养箱消化 3‑5min，镜下细胞收缩变圆，间隙分开，马上终止消化。

添加含血清完全培养基中和胰酶活性，轻柔吹打瓶壁，使星形胶质细胞脱落，制备均匀细胞悬液。

细胞悬液转移无菌离心管，1000r/min 离心 5min，离心结束，小心吸取丢弃上清废液，保护细胞沉淀。

星形胶质细胞完全培养基重悬细胞沉淀，充分混匀后计数，按照实验需要密度接种新培养瓶。

轻轻晃动培养瓶让细胞均匀铺展，放入 37℃、5% CO₂培养箱培养，24h 镜检贴壁，每 2‑3 天更换新鲜培养基。