兔乳腺成纤维细胞

方法简介  实验室分离的兔乳腺成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔乳腺成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔乳腺成纤维细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔乳腺成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

倒置显微镜观察兔乳腺成纤维细胞，汇合度到达 80%‑85% 进行传代，确认细胞无污染，梭形形态完好，吸除瓶内旧培养基。

无菌 PBS 缓冲液加入培养瓶，轻柔洗涤贴壁细胞 2 次，晃动瓶子清除残留血清和漂浮碎片，洗涤结束完全吸除 PBS 废液。

加入预热胰酶‑EDTA 消化液浸润全部细胞层，37℃5% CO₂培养箱消化 3‑5min，镜检细胞皱缩变圆，即刻终止消化。

添加含胎牛血清的完全培养基中和胰酶，沿瓶壁分次吹打贴壁部位，使乳腺成纤维细胞脱落，制备均匀细胞悬液。

将全部细胞悬液转入无菌离心管，1000r/min 离心 5min，离心结束，缓慢吸弃上清，留存底部细胞沉淀。

加入预热完全培养基重悬细胞沉淀，充分混匀后细胞计数，按照实验需要的密度接种于新培养瓶。

平缓晃动培养瓶让细胞分散均匀，放置 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，24h 查看贴壁情况，每 2‑3 天更换新鲜培养基。