兔前脂肪细胞

方法简介  实验室分离的兔前脂肪细胞采用胶原酶消化法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔前脂肪细胞经成脂诱导功能验证，诱导成脂后，经油红O定性检测阳性，成脂染色数占比>60%，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔前脂肪细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔前脂肪细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取皮下脂肪或棕色脂肪组织

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12培养基、FBS、PBS、IBMX、地塞米松、胰岛素

分离纯化步骤

取实验动物脂肪组织，剪碎后加入II型胶原酶(1mg/mL)37度振荡消化1-2小时

消化液经70um滤网过滤，100g离心10分钟收集沉渣(含前脂肪细胞和脂肪细胞)

去除上层脂肪层，将沉渣重悬于PBS中，再次离心纯化

沉淀细胞接种于培养皿中，贴壁细胞即为前脂肪细胞/脂肪间充质干细胞

原代培养要点

前脂肪细胞使用DMEM/F12+10%FBS培养基，37度、5% CO2培养

细胞呈梭形贴壁生长，融合达80-90%时传代

诱导分化：换用分化培养基(DMEM+10%FBS+0.5mM IBMX+1uM地塞米松+10ug/mL胰岛素)诱导48-72小时后换维持培养基

脂肪细胞培养7-14天后可观察到明显脂滴积累，Oil Red O染色阳性

常见问题优化

前脂肪细胞得率低：延长胶原酶消化时间至2小时，适当提高酶浓度

分化效率低：确保诱导培养基中各组分新鲜配制，IBMX需现用现配

细胞老化：控制传代次数在5代以内，早期代次分化潜能更佳

显微镜观察兔前脂肪细胞生长，细胞汇合 75%‑80% 执行传代，观察细胞无脂滴异常堆积、无微生物污染，吸除原有培养基。

使用无菌 PBS 缓冲液漂洗细胞贴壁面 2 次，缓慢摇晃培养瓶，洗去代谢残渣，漂洗完成后彻底吸净 PBS 缓冲液。

加入预热胰蛋白酶消化液覆盖细胞层，放置 37℃5% CO₂培养箱消化 2‑4min，镜下细胞形态变圆，间隙增大，立即终止消化。

加入含血清完全培养基中和胰酶，轻柔吹打瓶壁，使前脂肪细胞脱落，制备单细胞悬液，吹打力度不宜过大，防止诱导提前分化。

细胞悬液转移无菌离心管，1000r/min 离心 5min，离心完毕，小心去除上层上清，保留管底细胞沉淀。

加入前脂肪细胞专用完全培养基重悬沉淀，混匀后计数，调整细胞密度接种至新培养器皿。

轻轻摇匀细胞悬液，放入 37℃、5% CO₂培养箱培养，24h 观察贴壁，每 2‑3 天更换培养基，未诱导分化前避免细胞高密度堆积。