兔前列腺成纤维细胞

方法简介  实验室分离的兔前列腺成纤维细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔前列腺成纤维细胞经Vimentin免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔前列腺成纤维细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔前列腺成纤维细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，取健康组织块约0.5-1g

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液、DMEM/F12完全培养基、胎牛血清(FBS)

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质

剪碎组织至1mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶，37度消化30-40分钟

加入II型胶原酶继续消化30分钟，胎牛血清终止消化

经70um和40um滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

重悬细胞后接种于未包被培养皿中，37度培养24小时后换液去除悬浮细胞

原代培养要点

成纤维细胞贴壁能力强，接种后12-24小时大部分细胞贴壁，呈梭形或星形

使用DMEM/F12+10%FBS完全培养基，37度、5% CO2培养

每2-3天换液一次，细胞融合达80-90%时可用0.25%胰蛋白酶消化传代

原代成纤维细胞增殖较快，通常7-14天可达融合状态

常见问题优化

成纤维细胞生长过快：适当降低FBS浓度至5-10%可减缓生长速度

细胞老化：控制传代次数在10代以内，早期代次实验结果更可靠

交叉污染：严格无菌操作，注意区分成纤维细胞与肌成纤维细胞表型

显微镜观察兔前列腺成纤维细胞生长状态，细胞汇合至 80%‑90% 开展传代，确认无细菌、支原体污染，吸除培养瓶中旧的细胞培养基。

添加无菌 PBS 缓冲液洗涤贴壁细胞两层，缓慢摇晃培养瓶，清除残留血清与细胞碎片，洗涤结束后完全吸净 PBS 废液。

加入预热胰酶消化液，液体铺满细胞贴壁面，移入 37℃5% CO₂培养箱孵育消化 3‑5min，镜下看到细胞回缩、轮廓变圆，马上准备终止消化。

加入含血清完全培养基中和胰蛋白酶作用，沿瓶壁缓慢吹打贴壁区域，把梭形成纤维细胞吹打脱离瓶壁，制成均匀细胞悬液，减少机械剪切力。

全部细胞悬液移入无菌离心管，1000r/min 离心 5min，离心完成，缓慢移除上清废液，保留管底细胞沉淀。

加入预热完全培养基充分重悬细胞沉淀，充分混匀后做细胞计数，依据实验需求调整细胞密度，接种到新无菌培养容器。

水平轻晃培养容器让细胞分散均匀，放入 37℃、5% CO₂培养箱孵育，次日镜检贴壁情况，每 2‑3d 更换培养基，成纤维细胞避免过度汇合防止老化。