以药找靶：DARTS-MS实验服务

以药找靶：DARTS-MS实验服务

一、DARTS-MS技术介绍

DARTS-MS( Drug Affinity Responsive Target Stability- mass spectrometry)，即药物亲和反应靶点稳定性-质谱联用技术，是一种筛选化合物结合靶点蛋白的实验方法。

相较于游离状态下的蛋白质，当小分子配体与靶蛋白形成复合物时，由于氢键等非共价相互作用的存在，蛋白配体复合物往往表现出更高的结构稳定性。在应用蛋白酶对样品进行处理的过程中，与配体结合的蛋白展现出增强的抗水解能力，其水解程度相较于未结合小分子的蛋白显著降低。通过SDS-PAGE电泳结合质谱鉴定技术，可以对实验组与对照组的差异蛋白质进行定量鉴定分析，从而筛选并确认配体的潜在靶点蛋白。

二、DARTS-MS靶蛋白垂钓技术基本步骤（实验材料以细胞裂解液为例）

1.        细胞裂解，提取总蛋白（注：使用温和的裂解液，保持蛋白活性或通过反复冻融的方法提取总蛋白）。

2.        将化合物或对照与总蛋白孵育，孵育后，化合物与靶蛋白结合，改变其对蛋白酶K的水解敏感性。

3.        孵育完成后，加入适量蛋白酶K水解总蛋白，水解完成后进行热处理失活蛋白酶K。

4.        进行SDS-PAGE电泳，寻找差异条带，将差异条带进行定量蛋白质组鉴定。

图2  DARTS-MS实验基本流程图^[1] 

三、案例介绍

Adv Sci | DARTS-MS结合SPR、分子对接、DARTS、CETSA技术筛选鉴定新百叶藤碱衍生物结合靶点^[2]

1、DARTS-MS技术鉴定新白叶藤碱衍生物Z24靶点蛋白

在前期的研究当中，作者发现新白叶藤碱衍生物Z24具有良好的抗植物病原真菌活性。

为了寻找Z24的真菌作用靶点，作者采取了DARTS-MS的实验方法（图1A）：取500ug 真菌总蛋白，加入Z24或者DMSO于25℃下孵育60min，随后加入蛋白酶K（1：500）进行水解（37℃，30min），水解完成后95℃处理5min终止反应。反应完成进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后将差异蛋白切下进行质谱鉴定。

通过DARTS-MS技术，作者发现Bcthi4是Z24的潜在结合靶点（图1C，1D）

图1 DARTS-MS鉴定Z24的潜在蛋白结合靶点

DARTS-MS实验方法

Total protein was extracted using a Fungal Protein Extraction Kit (Kanglang, Shanghai, China), and the protein was quantified to 5 mg/ml. Cell lysates were aliquoted into equivalent volumes containing 500 μg of protein and incubated for 60 min at 25°C with or without Z24. Pronase E from Streptomyces griseus (Solarbio, Beijing, China) was added to all samples at a pronase E:substrate mass ratio of 1:500 and incubated at 37°C for 30 min. To identify differential protein bands, SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was performed, followed by Coomassie bright blue and silver staining.

2、SPR（表面等离子共振）、分子对接、DARTS、CETSA验证Z24与Bcthi4结合

随后作者通过分子对接（Autodock Vina）预测了Z24和Bcthi4的结合模式。对接结果显示，二者的结合能为-8.185 kcal/mol（图2A）。作者进一步通过SPR（表面等离子共振）实验证明了Z24和Bcthi4的结合（图2B)。SPR实验流程：首先将Bcthi4蛋白固定再CM5芯片上，固定完成后，将Z24稀释6个梯度(0、6.25、12.5、25、50、100 uM)进样。测得Z24与Bcthi4间的KD值为94.25uM；通过CETSA（细胞热迁移分析）证明Z24能提高Bcthi4的热稳定性（图2C）；通过DARTS实验（图2D），表明Z24能抑制蛋白酶K对Bcthi4的水解。综上，Bcthi4是Z24的作用靶点。

图2 SPR（表面等离子共振）、分子对接、DARTS、CETSA验证Z24和Bcthi4结合

四种以药找靶技术对比

参考文献

[1]       Zhang C, Cui M, Cui Y, Hettinghouse A, Liu CJ. A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction. J Vis Exp. 2019;(150):10.3791/59656. Published 2019 Aug 27. doi:10.3791/59656

[2]       Zhao WB, An JX, Jin YR, et al. Indoloquinoline alkaloid neocryptolepine derivative inhibits Botrytis cinerea by targeting thiamine thiazole synthase. Sci Adv. 2025;11(11):eadq5329. doi:10.1126/sciadv.adq5329

样品准备要求：

1、送样形式以细胞沉淀或者提取的总蛋白溶液

2、药物5-10mg，冰袋寄送即可，也可与细胞或蛋白样品一起寄送

3、细胞沉淀需要6×10⁷及以上，沉淀经PBS清洗三次，去除残留PBS，以沉淀形式寄送

4、总蛋白浓度2mg/ml及以上，不少于4ml（注：所用裂解液必须为弱裂解液，需要保持蛋白活性，蛋白酶抑制剂需使用质谱兼容型）

5、细胞及蛋白样品使用干冰寄送，干冰用量5kg/天（即快递需要1天，使用5kg干冰；2天使用10kg干冰，依次类推）

其他服务

基于DARTS原理结合质谱鉴定技术筛选靶药物靶点蛋白；

多平台多维度验证：

生物物理水平：SPR、MST、BLI、ITC等；

生物化学水平：小分子pull-down、CETSA、DARTS等；

细胞水平：小分子免疫荧光等