兔脑动脉血管平滑肌细胞

兔脑动脉血管平滑肌细胞

基于酶消化-差速贴壁联合策略从新西兰大白兔脑动脉血管平滑肌细胞组织获取平滑肌细胞，经 0.1% 胶原酶 IV 消化 2h 后通过 30% 胎牛血清梯度贴壁纯化，接种于纤连蛋白包被培养皿中，使用 DMEM 高糖培养基（含 15% FBS、10 ng/mL EGF 及 50 μg/mL 抗坏血酸）培养；通过免疫荧光双标检测 α-SMA/SM-MHC 共表达，RT-qPCR 分析平滑肌分化标志基因转录水平，并观察细胞在收缩刺激下的形态变化。

产品名称：兔脑动脉血管平滑肌细胞

英文名称： Rabbit Cerebral Artery Smooth Muscle Cells

组织来源： 脑动脉组织

默认种属 ：新西兰大白兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔脑动脉平滑肌细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来。

质量检测  实验室分离的兔脑动脉血管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养基：  兔脑动脉血管平滑肌细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、EGF、bFGF、Insulin、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 成纤维细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传5代左右；3代以内状态最佳

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔脑动脉血管平滑肌细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

步骤一：无菌术前准备与耗材预处理 实验前30min开启超净工作台与生物安全柜紫外消毒，用75%医用酒精全面擦拭工作台台面、移液器、离心管架等所有实验器具，提前预热细胞专用完全培养基、PBS缓冲液至37℃。准备无菌眼科剪、眼科镊、15mL离心管、细胞培养瓶、0.22μm滤器等耗材，所有器械提前高压灭菌烘干。同时配置0.125%胰酶-EDTA消化液、血管平滑肌细胞专用培养液，全程保证实验环境无菌无尘，杜绝杂菌污染，为后续细胞分离培养奠定基础。

步骤二：脑组织取材与血管组织剥离纯化 选取健康成年家兔，无菌条件下快速断头取脑，立即将脑组织移入预冷的无菌PBS缓冲液中，反复漂洗3-4次，彻底清除表面血液、脑脊液及残留杂质。借助体视显微镜，精准剥离兔脑表面完整的脑动脉血管，小心剔除血管外壁粘连的结缔组织、脂肪组织及神经纤维，仅保留纯净的动脉血管管壁组织，全程操作轻柔，避免血管组织破损、细胞损伤，剥离完成后再次用预冷PBS漂洗2次。

步骤三：组织剪切与预处理净化 将纯化后的脑动脉血管转移至无菌培养皿中，用无菌眼科弯剪反复剪切，将组织剪碎至1mm³左右的均匀细小组织碎块，剪切过程中持续滴加少量预冷PBS保持组织湿润。将剪切后的组织碎块移入15mL无菌离心管，加入5mL无菌PBS，轻轻吹打混匀，静置1min后弃去上清液，重复漂洗3次，彻底去除组织碎片中的细胞碎屑、残留血液，保证组织样本洁净度。

步骤四：恒温酶解消化与细胞解离 向离心管内的血管组织碎块中加入4mL提前预热至37℃的0.125%胰酶-EDTA消化液，轻轻吹打使组织碎块完全浸没在消化液中。将离心管置于37℃恒温水浴锅中避光消化20-25min，期间每5min轻柔颠倒混匀一次，让消化液与组织充分接触，充分降解细胞外基质与细胞间连接结构，促使平滑肌细胞从血管壁组织中解离。消化后期实时观察组织状态，避免过度消化导致细胞活性下降。

步骤五：终止消化与细胞悬液制备 消化完成后，立即加入等体积的血管平滑肌专用完全培养基，轻柔吹打混匀，快速终止胰酶的消化作用，防止细胞受损。用无菌100目细胞筛过滤混合液，去除未完全消化的组织残渣、结缔组织碎片，收集纯净的细胞滤液至全新15mL无菌离心管中，反复轻柔吹打滤液，制备均匀的单细胞悬液，避免细胞抱团聚集。

步骤六：离心纯化与细胞沉淀收集 将装有细胞悬液的离心管放入离心机，设置转速1000r/min、室温离心10min，离心结束后缓慢取出离心管，可清晰观察到管底乳白色细胞沉淀。小心缓慢吸弃上层澄清上清液，全程避免触碰管底细胞沉淀，随后向离心管内加入2mL预热的完全培养基，用移液器轻柔吹打重悬细胞沉淀，充分分散细胞，无明显细胞团块。

步骤七：细胞接种与恒温培养 将重悬后的单细胞悬液按照适宜密度接种至提前包被处理的细胞培养瓶中，补充足量血管平滑肌专用完全培养基，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶底部。将培养瓶置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的恒温细胞培养箱中静置培养，接种后24h内禁止移动培养瓶，保证细胞充分贴壁，后续每日观察细胞贴壁、增殖状态，每48h更换一次新鲜培养基。

1.实验全程需在生物安全柜中操作，避免空气中的微生物污染培养体系。

2.培养器皿需用0.1%明胶溶液包被30分钟以上，去除未结合明胶后使用。

3.该细胞体外传代能力较强，建议3-5代内使用，过高代次可能导致收缩表型标志物表达下降。

4.培养基中需添加20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以维持细胞增殖活性。

5.建议传代比例为1:2，每2-3天更换新鲜培养基，维持细胞最佳生长状态。