兔角膜内皮细胞

兔角膜内皮细胞

从新西兰大白兔角膜内皮细胞组织标本经胶原酶-弹性蛋白酶联合消化获取单细胞悬液，通过 Percoll 密度梯度离心纯化内皮细胞组分，接种于纤维连接蛋白预包被的培养皿中，使用内皮基础培养基 supplemented with 多种生长因子（VEGF、FGF-2、IGF-1 及 Ascorbic acid）维持培养；通过免疫荧光染色显示 CD31 膜染色阳性、vWF 胞质颗粒状表达，并结合乙酰化 LDL 荧光摄取实验和内皮管腔形成 assay 综合鉴定。

产品名称：兔角膜内皮细胞

英文名称： Rabbit Corneal Endothelial Cells

组织来源： 眼角膜组织

默认种属 ：新西兰大白兔

产品规格：5×10^5Cells/T25

方法简介  实验室分离的兔角膜内皮细胞采用混合胶原酶消化结合内皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔角膜内皮细胞经NSE（神经元特异性烯醇化酶）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： PLL（0.1 mg/mL）或明胶（0.1%）

培养基： 兔角膜内皮细胞完全培养基(含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 内皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传2-3代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔角膜内皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

一、实验前准备

1. 试剂：DMEM 高糖、10% FBS、双抗、0.25% 胰酶、0.1% 胶原酶、无菌平衡盐 BSS 液。

2. 耗材：显微眼科剪、显微镊、培养皿、离心管，新西兰大白兔为实验动物。

3. 所有显微器械单独灭菌，操作台面无菌处理。

二、取材与预处理

1. 白兔耳缘静脉空气栓塞处死，摘取双侧眼球，BSS 液冲洗眼球表面污物。

2. 显微镜下沿角膜缘剪开眼球，完整分离角膜片，内皮面朝上置于培养皿，BSS 漂洗 2 次。

三、细胞分离与消化

1. 滴加胰酶 - 胶原酶混合液覆盖角膜内皮面，37℃孵育 12~15min。

2. 用显微镊轻轻刮取内皮层，培养基吹打收集细胞悬液。

3. 离心 800r/min 5min，弃上清，BSS 洗涤沉淀。

四、纯化与接种培养

1. 完全培养基重悬细胞，接种于包被多聚赖氨酸的培养板 / 瓶。

2. 24h 换液去除漂浮细胞，每 3 天换液一次，角膜内皮细胞增殖能力弱，尽量少传代。

3. 细胞汇合后可冻存保种，ZO-1、N-cadherin 鉴定角膜内皮特征。

1.实验全程需在生物安全柜中操作，避免空气中的微生物污染培养体系。

2.常规培养皿经PBS冲洗后即可使用，平滑肌细胞具有较强的自主贴壁能力。

3.该细胞对培养条件较为敏感，建议初次培养时设置多个平行实验以提高成功率。

4.添加5ng/ml转化生长因子-beta(TGF-beta)以调节细胞表型和功能维持。

5.换液时弃去旧培养基后用PBS轻柔洗涤一次再加入新鲜培养基，可减少代谢废物积累。