兔甲状腺滤泡上皮细胞

方法简介  实验室分离的兔甲状腺滤泡上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶混合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来。

质量检测  实验室分离的兔甲状腺滤泡上皮细胞经TG（甲状腺球蛋白）免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

包被条件： 鼠尾胶原Ⅰ（2-5 μg/cm²）

培养基： 兔甲状腺滤泡上皮细胞完全培养基(基础培养基，含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等)

换液频率： 每2-3天换液一次

生长特性： 贴壁

细胞形态： 上皮细胞样

传代比例： 1:2

传代特性： 可传1-2代

消化液： 0.25%胰蛋白酶

兔甲状腺滤泡上皮细胞体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的最佳培养状态。

前置准备

实验动物：新西兰大白兔，组织取材量充足，活力>85%

试剂：0.25%胰蛋白酶、II型胶原酶、DNase I、DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、PBS缓冲液

分离纯化步骤

取实验动物目标组织，用预冷无钙镁PBS反复冲洗去除血液和杂质，剪碎至1mm3大小

加入0.25%胰蛋白酶和II型胶原酶混合消化液，37度消化30-40分钟，期间振荡2-3次

消化完成后加入含20%胎牛血清的完全培养基终止消化，用移液器反复吹打分散

依次过70um、40um细胞滤网过滤，300g离心8分钟收集细胞沉淀

用完全培养基重悬细胞，计数并检测活力，调整细胞密度后进行接种

原代培养要点

调整细胞密度至5x10^4-1x10^5 cells/cm2接种于胶原包被培养皿，37度、5% CO2培养

上皮细胞贴壁较慢，通常需24-48小时方可观察到贴壁细胞，建议48小时首次换液

培养基每2-3天更换一次，使用含10% FBS的DMEM/F12完全培养基

细胞融合达80-90%时可进行传代，建议采用温和的胰蛋白酶-EDTA(0.05%)消化传代

常见问题优化

细胞贴壁率低：使用多聚赖氨酸或胶原预包被培养皿表面，可显著提高贴壁效率

上皮细胞生长缓慢：培养基中添加0.1mM IBMX和5ug/mL胰岛素，可促进上皮细胞增殖

交叉污染：严格无菌操作，培养基中添加双抗(100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)

冻存细胞复苏：取出冻存管，37℃水浴快速融化，轻微摇晃，冰晶基本消融，75% 酒精消毒管壁，超净台将细胞悬液转移至预热完全培养基的 15mL 离心管。

离心去除冻存保护剂：配平离心管，1000rpm 离心 5min，小心吸走上清液，留存底部细胞沉淀。

重悬分散细胞沉淀：加入 2‑3mL 兔甲状腺滤泡上皮细胞专用完全培养基，轻柔吹打沉淀，打散细胞团块，制备均匀细胞悬液。

细胞计数接种：计数细胞，接种密度 6×10⁴‑1.2×10⁵cells/cm²，补加足量完全培养基，十字摇晃培养瓶，让上皮细胞均匀铺于瓶底。

培养箱静置孵育：置于 37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱静置孵育，24h 之内尽量不移动培养容器，方便上皮细胞贴壁。

换液观察细胞形态：复苏 24h 镜检贴壁，弃旧培养基，更换新鲜预热完全培养基，去除悬浮死亡细胞，每 2‑3 天换液，观察上皮鹅卵石样形态。

传代扩增培养：细胞汇合 80%‑85%，PBS 洗涤细胞层，胰酶消化，镜下细胞回缩变圆，立刻加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液离心，分瓶传代扩增。